銪、金納米顆粒與蛋白質(zhì)的相互作用及分析應(yīng)用的研究.pdf

1、【目的】研究嗅標(biāo)記蛋白(Olfactory Marker Protein，OMP)對(duì)銪、金納米顆粒的熒光增強(qiáng)效應(yīng)，建立靈敏的測(cè)定蛋白質(zhì)含量的分析方法，探討銪、金納米顆粒與蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)理。 【方法】 1.銪納米顆粒與蛋白質(zhì)的相互作用及分析應(yīng)用的研究在Eu(NO3)3溶液中加入還原劑單寧酸，30℃條件下劇烈攪拌30 min，冷卻至室溫后離心、洗滌、定容即得到銪納米顆粒。在攪拌過(guò)程中緩慢加入修飾劑硫辛酸，冷卻至室溫后離心

2、、洗滌、定容，再加入嗅標(biāo)記蛋白OMP，37℃條件下水浴8h，可將OMP連接到銪納米顆粒。研究OMP對(duì)銪納米顆粒的熒光增強(qiáng)效應(yīng)和OMP含量與熒光強(qiáng)度變化的關(guān)系。同時(shí)應(yīng)用共振光散射技術(shù)、吸收光譜技術(shù)、透射電子顯微技術(shù)、圓二色譜技術(shù)等手段進(jìn)行機(jī)理研究和討論。 2.金納米顆粒與蛋白質(zhì)的相互作用及分析應(yīng)用的研究在煮沸攪拌條件下向氯金酸溶液中加入還原劑檸檬酸三鈉，繼續(xù)加熱攪拌15 min后停止加熱，冷卻至室溫后離心、洗滌、定容即得到金納米顆

3、粒。在攪拌過(guò)程中緩慢加入修飾劑硫辛酸，冷卻至室溫后離心、洗滌、定容，再加入嗅標(biāo)記蛋白OMP，在37℃條件下水浴8h，可制得與OMP結(jié)合的金納米顆粒。研究OMP對(duì)金納米顆粒近紅外熒光增強(qiáng)作用以及OMP含量與熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的關(guān)系。同時(shí)應(yīng)用共振光散射技術(shù)、吸收光譜技術(shù)、透射電子顯微技術(shù)、圓二色譜技術(shù)等手段對(duì)熒光增強(qiáng)效應(yīng)機(jī)理進(jìn)行研究和討論。 【結(jié)果】 1.銪納米顆粒與蛋白質(zhì)的相互作用及分析應(yīng)用的研究在271 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，OM

4、P的加入能顯著增強(qiáng)銪納米顆粒在379 nm處的熒光強(qiáng)度，且熒光增強(qiáng)程度與OMP的含量在一定范圍內(nèi)呈正比。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定OMP、HRP、P450、BSA和NSE的線(xiàn)性范圍分別為2.0x10-8-8.0x10-6 g/mL、2.0x10-8.9.0x10-6 g/mL、6.0x10-8-1.2×10-5g/mL、6.0x l0-8-1.0×10-5g/mL和3.0xl0-8-1.2×10-5g/mL。它們的檢出限分別為9.8×10-

5、9g/mL、1.0×10-8g/mL、2.9×l0-8g/mL、3.2×10-8g/mL和1.2×10-8g/mL。該方法用于模擬樣品中OMP含量的測(cè)定，結(jié)果令人滿(mǎn)意。機(jī)理研究表明，銪納米顆粒、硫辛酸與OMP發(fā)生了相互作用，使得OMP的構(gòu)象發(fā)生變化，形成了銪.硫辛酸-OMP絡(luò)合物，在27l nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，體系可能發(fā)生了能量傳遞過(guò)程，即OMP中的色氨酸殘基和酪氨酸殘基將吸收的能量通過(guò)硫辛酸這個(gè)中介體傳遞給銪納米顆粒，從而發(fā)射銪納米顆粒

6、的熒光峰，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。 2.金納米顆粒與蛋白質(zhì)的相互作用及分析應(yīng)用的研究實(shí)驗(yàn)表明，在538 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，OMP的加入可以顯著增強(qiáng)金納米顆粒在近紅外區(qū)的811 nm處的熒光強(qiáng)度，并且熒光增強(qiáng)程度與OMP的含量在一定范圍內(nèi)呈正比，可用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，檢測(cè)OMP、HRP、P450、BSA和NSE的線(xiàn)性范圍分別為2.0×1 0-5-9.0x10-6g/mL、3.0×10-8-8.0x10-6 g/mL、

7、8.0x10-8-1.2×10-5 g/mL、5.0×10-8-1.0×10-5g/mL，和5.0x10-8-8.0×10-6g/mL。檢出限分別為6.2×10-9g/mL，8.4×10-9g/mL、5.5×10-9g/mL、6.0x10-9 g/mL和9.7×10-9g/mL?？梢?jiàn)該方法有較高的靈敏度和較寬的線(xiàn)性范圍。對(duì)模擬樣品采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定OMP含量，并將結(jié)果和用紫外吸收法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果精密度和準(zhǔn)確度均比較滿(mǎn)意。機(jī)理研

8、究表明，帶有巰基的硫辛酸將金納米顆粒與OMP連結(jié)起來(lái)，形成了金-硫辛酸-OMP復(fù)合物，并定向排列聚集成超晶格結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致表面等離子體傳播特性改變，使金納米顆粒近紅外區(qū)的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。 【結(jié)論】 1.OMP可以顯著增強(qiáng)銪納米顆粒的熒光強(qiáng)度和金納米顆粒在近紅外區(qū)的熒光強(qiáng)度。 2.利用蛋白質(zhì)對(duì)銪、金納米顆粒的熒光增強(qiáng)效應(yīng)可以建立測(cè)定蛋白質(zhì)含量的新方法，結(jié)果令人滿(mǎn)意。 3.在銪納米顆粒、硫辛酸、OMP三者間的能

9、量傳遞過(guò)程使銪納米顆粒的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而OMP對(duì)金納米顆粒的熒光增強(qiáng)效應(yīng)則是由表面等離子體傳播特性改變引起的。 本論文的主要特點(diǎn)和創(chuàng)新點(diǎn)： 1.利用稀土元素良好的發(fā)光性能和金屬納米材料檢測(cè)生物分子靈敏度高的特點(diǎn)制備了銪納米顆粒，探索建立測(cè)定蛋白質(zhì)含量的分析方法。 2.在前人工作的基礎(chǔ)上研究了蛋白質(zhì)對(duì)金納米顆粒近紅外熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)效應(yīng)，提高其測(cè)定蛋白質(zhì)含量的靈敏度。 3.利用熒光技術(shù)、光散射技術(shù)、吸收光