基于移動反應界面的聚丙烯酰胺凝膠電泳及其應用研究.pdf

1、聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）作為一種經典的分離分析技術，因為其成熟的操作，很好的分離效果，商業(yè)化的電泳裝置，已經在生農化醫(yī)等實驗室被廣泛的應用于蛋白質、DNA、納米粒子等物質的分離分析中。從19世紀60年代提出該方法以來，PAGE在其應用范圍和方法的靈敏度提高方面得到了很大的發(fā)展，但仍然有兩點有待發(fā)展，一是PAGE分離的原理多是基于等速電泳的原理（不像毛細管電泳已經

2、發(fā)展出超過十種分離模式）；二是經典的PAGE上樣量一般不高于15μl，上樣量大則分辨率變差。近年來，移動反應界面（moving reaction boundary，MRB）理論發(fā)展很迅速，尤其是移動中和界面（moving neutralization boundary，MNB）已用于化學分析中包括等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）、酸堿滴定等基礎研究和兩性電解質和小分子藥物的富集應用研究。本文將移動反應界面的原

3、理應用到PAGE中解決了存在的兩個問題，以血紅蛋白為模式蛋白，對其成功的進行了分離和富集，使靈敏度達到了至少8倍的提高。
　　本論文的綜述部分包括三個部分。1.聚丙烯酰胺凝膠電泳的基礎理論及其發(fā)展應用。2.移動反應界面原理的發(fā)展，分類和應用。3.血紅蛋白的種類和性質，與臨床診斷相關的兩種蛋白的研究意義和常用的分析方法。實驗分為兩個部分，首先是建立分離血紅蛋白的MRB-PAGE模型，然后是通過等電聚焦，MALDI-TOF MS對MR

4、B-PAGE分離得到的血紅蛋白條帶進行鑒定。
　　在本課題的第一部分，我們根據已有的商業(yè)化的垂直電泳裝置構建了MRB-PAGE分離大體積低豐度蛋白的理論模型，根據模型優(yōu)化了膠濃度，交聯度，三種關鍵緩沖液的濃度和pH值等參數。在第二部分中，使用優(yōu)化好的體系進行了模式蛋白血紅蛋白的分離，與包括經典 PAGE在內的三種分離模式進行了比較，靈敏度至少提高了8倍，并結合IEF，MS等技術對所分離的血紅蛋白條帶進行了鑒定，得到了較為滿意的結果