05 生物化學實驗--聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離血清蛋白質

1、聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離血清蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離血清蛋白質【目的目的】1掌握圓盤電泳分離血清蛋白的操作技術。2熟悉聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理。【原理原理】帶電粒子在電場中向著與其自身電荷方向相反的電極移動，稱為電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）就是以聚丙烯酰胺凝膠作為電泳介質的電泳。在電泳時，蛋白質在介質中的移動速率與其分子的大小，形狀和所帶的電荷量有關。聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，是由丙烯酰胺（Acr）單體和少量交聯

2、劑NN亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑過硫酸銨（Ap）和加速劑四甲基乙二胺（TEMED）的作用下發(fā)生聚合反應而制得的（其化學結構式見第2篇第1章）。聚丙烯酰胺凝膠具有網狀結構，其網眼的孔徑大小可用改變凝膠液中單體的濃度或單體與交聯劑的比例來加以控制。根據血清蛋白分子量的大小，學生實驗一般選用7％聚丙烯酰胺凝膠分離血清蛋白質。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳利用濃縮效應、分子篩效應和電荷效應的三重作用分離物質（見第2篇第1章），使樣品分離效果好

3、，分辨率較高。一般醋酸纖維薄膜電泳只能把血清蛋白質分離出5～7條帶，而聚丙烯酰胺凝膠電泳卻能分離出十幾條到幾十條來（圖34），是目前較好的支持介質，應用十分廣泛。圖34血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜1丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺一般性的分析工作，用分析純的Acr和Bis即可，精細的分析工作，尤其是分子量的測定和定量分析，需商品Acr和Bis進行重結晶，進一步純化。2N，N，N＇，N＇—四甲基乙二胺（TEMED）商品TEMED即可，低溫，避光

4、保存。310%過硫酸銨溶液（AP，WV）10g過硫酸銨定容到10ml，最好使用新鮮配制的溶液。4染色液取三氯乙酸200g加水500ml，然后加入10g考馬斯亮藍R250用玻璃棒攪拌，待完全溶解后，再加入蒸餾水加至1000ml。5脫色液的配制取三氯乙酸100g加蒸餾水溶解后加至1000ml。6儲備液的配制電極緩沖液、凝膠緩沖液及凝膠儲備液配制見下表：緩沖液Tris5.98g1molLHCl48ml加蒸餾水至100mlPH6.7濃縮膠凝膠儲