聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分析過(guò)氧化物酶同工酶

1、班級(jí)：植物118姓名：凌云學(xué)號(hào)：1101080807聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分析過(guò)氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分析過(guò)氧化物酶同工酶2012.12.11研究背景：研究背景：同工酶是指能催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)組成卻有所不同的一組酶。它們是DNA編碼的遺傳信息表達(dá)的結(jié)果。最近的研究表明，同工酶與生物的遺傳、生長(zhǎng)發(fā)、代謝調(diào)節(jié)及抗性等都有一定的關(guān)系。因此，測(cè)定同工酶在理論上和實(shí)踐上都有重要的意義。用聚丙烯酰胺凝膠電

2、泳測(cè)定同工酶，方法簡(jiǎn)便、靈敏度高，重現(xiàn)性強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果便于觀察、記錄和保存。過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中它的活性不斷發(fā)生變化。因此，測(cè)定這種酶的活性或其同工酶的變化情況，可以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝的變化。實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：電泳現(xiàn)象：帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)，稱為電泳(簡(jiǎn)稱EP)。本實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)，分離小

3、麥幼苗過(guò)氧化物酶同工酶，根據(jù)酶的生物化學(xué)反映，通過(guò)染色方法顯示出酶的不同區(qū)帶，以鑒定小麥幼苗過(guò)氧化物酶同工酶。影響電泳的主要因素：若將帶靜電荷q的粒子放入電場(chǎng)，則該粒子所收到的引力F引可用數(shù)學(xué)式表示如下：F引=Eq（1）式中E為電場(chǎng)強(qiáng)度，單位為“伏特厘米”，表示電場(chǎng)中單位距離上的電位差。如果這種情況發(fā)生在真空中，則帶電粒子會(huì)朝著電極加速前進(jìn)并且最后與電極相撞。但在溶液中，由于電場(chǎng)的牽引力F引與加速運(yùn)動(dòng)的粒子和溶液之間產(chǎn)生的阻力F引相對(duì)抗

4、，故上述現(xiàn)象不會(huì)發(fā)生。根據(jù)Stokes公式，阻力的大小取決于粒子的大小和形狀以及所在介質(zhì)的粘度：F阻=6πγηv（2）式中F阻是球形粒子所受的阻力，γ是球形粒子的半徑，η是溶液的濃度，v是粒子移動(dòng)的速度。在溶液中，由電場(chǎng)而產(chǎn)生的加速力被阻力所對(duì)抗，因此：Eq=6πγηv（3）整理可得：v=Eq6πγμ（4）由此可以看出，粒子移動(dòng)速度（v）與電場(chǎng)強(qiáng)度（E）和粒子所帶電荷量（q）成正比，而與粒子的大?。é茫┖腿芤旱恼扯龋é牵┏煞幢?。不難想象

5、，非球形粒子（如DNA）在電泳過(guò)程中會(huì)受到更大的阻力，即粒子的移動(dòng)速度還與粒子的形狀有關(guān)。由于帶電粒子的泳動(dòng)速度受場(chǎng)強(qiáng)影響，使得同一帶電粒子在不同電場(chǎng)里泳動(dòng)速度不同。為了便于分析比較，常用遷移率（泳動(dòng)度）代替泳動(dòng)速度表示粒子的泳動(dòng)情況，遷移率（泳動(dòng)度）的定義是：帶電粒子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度，若以m表示遷移率，則：m=vE（5）將（4）代入（5）式得：m=q6πγη（6）凝膠系統(tǒng)：本實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)，分離小麥苗過(guò)氧

6、化物酶的同工酶，系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（1）凝膠板由上、下兩層膠組成，兩層凝膠的孔徑不同。上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。（2）緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。本實(shí)驗(yàn)采用堿性系統(tǒng)。電極緩沖液為pH8.3的TrisGly緩沖液，濃縮膠為pH6.7的TrisHCl緩沖液。而分離膠為pH8.9的TrisHCl緩沖液。（3）由于pH不連續(xù)，在電場(chǎng)中形成了不連續(xù)的電位梯度。在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即

7、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)。在這三種效應(yīng)的共同作用下，待測(cè)物質(zhì)被很好地分離開(kāi)來(lái)。下面以本實(shí)驗(yàn)要分離的小麥苗過(guò)氧化物酶同工酶為例，分別說(shuō)明三種效應(yīng)的作用：（1）電荷效應(yīng)：各種酶蛋白按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場(chǎng)作用下向一定電極，以一定速度泳動(dòng)。（2）分子篩效應(yīng)：分子量小，形狀為球形的分子在電泳過(guò)程中受到阻力較小，移動(dòng)較快；反之，分子量大、形狀不規(guī)則的分子，電泳過(guò)程中受到的阻力較大，移動(dòng)較慢。這種效應(yīng)與凝膠過(guò)濾過(guò)程中的情況不同。（3）

8、濃縮效應(yīng)：待分離樣品中的各組分在濃縮膠中會(huì)被壓縮成層，而使原來(lái)很稀的樣品得到高度濃縮。其原因如下：A.由于兩層凝膠孔徑不同，酶蛋白向下移動(dòng)到兩層凝膠界面時(shí)，阻力突然加大，速度變慢。使得在該界面處的待分離酶蛋白區(qū)帶變窄，濃度升高。B.在聚丙烯酰胺凝膠中，雖然濃縮膠和分離膠用的都是TrisHCl緩沖液，但上層濃縮膠為pH6.7，下層分離膠為pH8.9。HCl是強(qiáng)電解質(zhì)，不管在哪層膠中，HCl幾乎都全部電離，Cl－布滿整個(gè)膠板。待分離的酶蛋白

9、樣品加在樣品槽中，浸在pH8.3和Tris甘氨酸緩沖液中。電泳一開(kāi)始，有效泳動(dòng)率最大的Cl－迅速跑到最前邊，成為快離子（前導(dǎo)離子）。在pH6.7條件下解離度僅有0.1～1％的甘氨酸（pI=6.0）有效泳動(dòng)率最低，跑在最后邊，成為慢離子（尾隨離子）。這樣，快離子和慢離子之間就形成了一個(gè)不斷移動(dòng)的界面。在pH6.7條件下帶有負(fù)電荷的酶蛋白，其有效泳動(dòng)率介于快慢離子之間，被夾持分布于界面附近，逐漸形成一個(gè)區(qū)帶。由于快離子快速向前移動(dòng)，在其原來(lái)

10、停留的那部分地區(qū)成了低離子濃度區(qū)，即低電導(dǎo)區(qū)。因?yàn)殡娢惶荻萔、電流強(qiáng)度I和電導(dǎo)率S之間有如下關(guān)系：V=IS所以在電流恒定條件下低電導(dǎo)區(qū)兩側(cè)就產(chǎn)生了較高的電位梯度。這種在電泳開(kāi)始后產(chǎn)生的高電位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢離子加速前進(jìn)，追趕快離子。本來(lái)夾在快慢離子之間的酶蛋白區(qū)帶，在這個(gè)追趕中被逐漸地壓縮聚集成一條更為狹窄的區(qū)帶。這就是所謂的濃縮效應(yīng)。在此區(qū)帶中，各種酶蛋白又按其電荷而分成不同層次，在進(jìn)入分離膠前被初步分離，形成若干條離得很近