中國海域文昌魚遺傳多樣性及實驗室品系培育.pdf

1、頭索動物文昌魚進化地位特殊，具有脊索動物門祖先的原始特征，是進行脊椎動物起源和演化、胚胎發(fā)育和比較基因組學(xué)研究的重要材料，具有重要的科研價值，同時文昌魚還是一種有養(yǎng)殖前景的經(jīng)濟物種。目前對文昌魚的研究主要集中在進化和發(fā)育生物學(xué)方面，對其分類學(xué)、遺傳多樣性和育種方面的研究則相對滯后。
　　 將材料運用于科學(xué)研究之前，首先必須對其進行正確的物種鑒定。本文根據(jù)形態(tài)特征鑒定了采集于粵東海域的短刀側(cè)殖文昌魚，并測定了其線粒體基因組全序列，

2、結(jié)合已報道的其它8種文昌魚線粒體基因組數(shù)據(jù)，對文昌魚屬的分類進行了探討。文昌魚線粒體基因排列順序、系統(tǒng)發(fā)育樹和遺傳距離均表明9種文昌魚應(yīng)分為3個屬，側(cè)殖文昌魚屬、鰓口文昌魚屬和偏殖文昌魚屬，短刀側(cè)殖文昌魚是側(cè)殖文昌魚屬的一種。雖然在形態(tài)學(xué)特征上鰓口文昌魚生殖腺位于身體兩側(cè)，側(cè)殖文昌魚和偏殖文昌魚生殖腺均位于一側(cè);但在分子水平，鰓口文昌魚和側(cè)殖文昌魚的線粒體基因排列順序一致，偏殖文昌魚則發(fā)生了較大的重組，系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系也顯示側(cè)殖文昌魚與鰓口

3、文昌魚親緣關(guān)系更近。本文通過線粒體基因組全序列澄清了短刀側(cè)殖文昌魚的屬名，并進一步探討了文昌魚屬之間的分類和進化關(guān)系，支持恢復(fù)偏殖文昌魚屬的分類地位。
　　 作為國際生命條形碼項目的主要分子標(biāo)記，COX1序列能夠很好地區(qū)分各個物種。進一步用COX1基因?qū)μ窖笪靼蹲畛Ｒ姷啮w口文昌魚屬的分類、分布、遺傳多樣性和地理種群分化情況進行了調(diào)查，結(jié)果表明太平洋西岸主要分布著三種鰓口文昌魚，即白氏文昌魚、日本文昌魚和馬來文昌魚。結(jié)合前人的文

4、獻報道，白氏文昌魚的分布區(qū)域應(yīng)在廈門以南，包括廈門、香港、茂名、北海等海域;日本文昌魚的分布范圍應(yīng)在香港以北，包括我國香港、廈門、青島、威海、昌黎和日本天草、西淡、南勢、渥美等海域;馬來文昌魚則分布在香港以南，包括我國香港和泰國的閣科考等海域?；贑OX1基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，遺傳距離和AMOVA分析結(jié)果均顯示，采自廈門、北海、茂名的白氏文昌魚沒有明顯分化，而我國青島、廈門和日本天草、西淡、南勢、渥美的日本文昌魚也沒有明顯分化。文昌魚各群體

5、的單倍型多態(tài)性很高，核苷酸多態(tài)性與其它水生動物相當(dāng)，總體來講太平洋西岸鰓口文昌魚屬的3種文昌魚群體遺傳多樣性均處于較高水平，同一物種的不同地理種群間沒有出現(xiàn)明顯的遺傳分化。
　　 研究文昌魚遺傳多樣性可以為文昌魚資源的保護和合理利用提供理論依據(jù)，同時也為文昌魚成為進化和發(fā)育生物學(xué)研究的模式動物提供遺傳學(xué)基礎(chǔ)資料。廈門海域的白氏文昌魚是世界上唯一形成過漁場的文昌魚，為了進一步研究白氏文昌魚遺傳多樣性，并為文昌魚遺傳育種工作做準(zhǔn)備，

6、本文構(gòu)建了白氏文昌魚微衛(wèi)星富集文庫，從中篩選到13個多態(tài)性位點，通過篩查基因組數(shù)據(jù)庫開發(fā)了289個多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。并使用其中20個微衛(wèi)星標(biāo)記，對20尾個體組成的白氏文昌魚廈門群體進行遺傳多樣性研究。結(jié)果表明白氏文昌魚廈門群體等位基因豐富，雜合度高，遺傳多樣性處于較高水平。微衛(wèi)星標(biāo)記與線粒體標(biāo)記的研究結(jié)果一致，均表明野生文昌魚群體遺傳多樣性高，個體差異大。對于文昌魚經(jīng)濟價值的開發(fā)和資源保護而言，遺傳多樣性高給文昌魚經(jīng)濟養(yǎng)殖和野生資源恢復(fù)

7、帶來了希望，也給良種選育提供了遺傳基礎(chǔ);但對于科學(xué)研究而言，遺傳多樣性高給文昌魚作為模式生物的應(yīng)用帶來了困難，用不同個體作為材料進行的發(fā)育生物學(xué)研究常常因個體差異大而影響實驗的重復(fù)性。因此，開發(fā)文昌魚經(jīng)濟價值，保護文昌魚野生資源，需要保存和利用文昌魚遺傳多樣性;而推動文昌魚模式化，則需要建立純度較高的品系，降低文昌魚實驗室養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性。
　　 遺傳多樣性的降低需要經(jīng)過小群體繁殖、近親交配、雌核發(fā)育等途徑實現(xiàn)，然而文昌魚幼

8、體階段死亡率很高，前人估算一對文昌魚的后代僅能存活5尾，因此我們首先探索提高文昌魚幼體存活率的方法，以我國科學(xué)研究者最常用的白氏文昌魚和日本文昌魚為材料，嘗試建立全同胞家系。在文昌魚性成熟時期，挑選健康雌雄個體作為備選親本，誘導(dǎo)其產(chǎn)卵釋精，將雌雄個體一對一配對，獲得全同胞家系。通過對受精卵質(zhì)量、海水清潔程度、光照強度等因素的控制和調(diào)節(jié)，提高了幼體存活率，一個家系最多有2300尾個體存活，最終成功建立了4個白氏文昌魚家系和7個日本文昌魚家

9、系，為下一步的品系培育打下基礎(chǔ)。
　　 根據(jù)實驗室模式動物和經(jīng)濟養(yǎng)殖物種的不同特點，需要篩選不同性狀的文昌魚，分別建立品系。與傳統(tǒng)的選育方法相比，構(gòu)建文昌魚遺傳連鎖圖譜可以為分子標(biāo)記輔助育種做準(zhǔn)備，有助于快速進行目的性狀的選育，加快文昌魚品系建立進程。本文運用微衛(wèi)星標(biāo)記和全同胞家系，嘗試構(gòu)建了白氏文昌魚遺傳連鎖圖譜。雌性遺傳圖譜有17個連鎖群，雄性連鎖圖譜有18個連鎖群，遺傳圖譜的連鎖群數(shù)目和白氏文昌魚單倍體染色體數(shù)目(20)較

10、為接近。雌性連鎖圖譜實際長度401.3 cM，預(yù)期長度744.9 cM，雄性連鎖圖譜實際長度304.2 cM，預(yù)期長度575.7cM，文昌魚單倍體染色體組堿基含量約260 Mb，因此圖譜長度與基因組實際長度比較接近。本文雌性圖譜長度是雄性圖譜的1.3倍，雌雄圖譜長度的差異反映了雌雄親本間的重組率可能存在性別差異。本文初步構(gòu)建了白氏文昌魚微衛(wèi)星遺傳連鎖圖譜，圖譜上定位的標(biāo)記數(shù)較少，尚不能直接應(yīng)用于性狀定位。這是在頭索動物亞門首次構(gòu)建的遺傳

11、圖譜，該圖譜為進一步構(gòu)建文昌魚高密度遺傳連鎖圖譜提供了基礎(chǔ)框架。
　　 把文昌魚培育成實驗室模式動物需要建立純系，才能為科學(xué)研究提供遺傳背景清楚，性狀均一、穩(wěn)定的實驗材料;而經(jīng)濟養(yǎng)殖中也需要將優(yōu)良性狀迅速固定下來，使其穩(wěn)定遺傳，并迅速增殖。雌核發(fā)育是快速建立純系的有效手段，其后代的遺傳物質(zhì)完全來自母本，后代個體間遺傳差異小，性狀也與母本高度相似。本文以白氏文昌魚為材料，探索了人工誘導(dǎo)文昌魚雌核發(fā)育的條件，并對文昌魚雌核發(fā)育二倍體