AML等腫瘤頻發(fā)的IDH2突變體的結構、功能與穩(wěn)定性研究.pdf

1、異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase，IDH)是一類在三羧酸循環(huán)中發(fā)揮關鍵作用的酶家族。人類基因組有5種IDH基因，可編碼生成三種異檸檬酸脫氫酶(IDH1、IDH2及IDH3)，其中IDH2位于線粒體，催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸(α-KG)和NADPH。已有研究表明在不同腫瘤中存在各種IDH突變體，包括急性髓細胞白血病(AML)、腦腫瘤、神經(jīng)膠質瘤等，其最為常見的突變堿基位于R132(IDH1)、R

2、140與R172(IDH2)。IDH突變體將α-KG轉化生成腫瘤代謝物2-羥戊二酸(2-HG)，從而紊亂了一系列α-KG依賴性雙加氧酶反應。具體表現(xiàn)為:促進組蛋白賴氨酸甲基化;抑制10-11易位酶家族(TET)羥甲基化，進而激活CpG島的DNA甲基化;穩(wěn)定缺氧誘導因子(HIF-1α)的表達，上調血管內皮生長因子(VEGF)。
　　本研究通過分析不同突變體的IDH2結構、功能與穩(wěn)定性，將對深入理解IDH2突變導致腫瘤發(fā)生、增殖的分子

3、機制及其診療提供一些線索和參考。本研究選用哺乳細胞表達載體pCMV6-AC-Myc-His，通過基因克隆、重疊PCR、雙酶切鑒定與測序成功構建11個IDH2重組表達載體:WT、R140G、R140Q、R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P。在此基礎上，在293T與小鼠小膠質細胞BV2中瞬時轉染過表達IDH2野生型與不同突變體，檢測蛋白表達與相關信號通路(Western)、細胞代謝（

4、檢測酶活力、葡萄糖及乳酸、ROS變化）、蛋白降解(Western)、蛋白質與熱激蛋白90相互作用（免疫共沉淀）等實驗，通過生物信息學同源模型構建，分析突變對IDH2結構的影響，并與藥物導致蛋白降解的結果進行相互驗證與比對，探究IDH2野生型和突變體之間結構、功能與穩(wěn)定性的差異。結果表明：野生型與突變體R140/R172在293T和BV2細胞中表達水平具有明顯差異；突變體IDH2酶活力顯著低于野生型；在293T細胞中，與野生型IDH2相比

5、較，R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P突變體過表達降低細胞乳酸含量，R172S、R172K、R172W、R172G突變體過表達導致葡萄糖含量升高，R140G、 R140Q、 R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C突變體ROS含量均顯著降低;不同突變體的過表達對細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路影響不同，其中多個突變體過表達抑制pAKT和pS6

6、的表達，并導致Cyclin D1表達下調;這些結果表明突變體IDH2過表達減緩了細胞代謝與生長。而在BV2細胞中，過表達R140Q、R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P突變體增加了TNF-α表達;其中R172S、R172M、R172W、R172G突變體過表達誘導IL-6表達，推測這些突變體的過表達可能與炎癥反應的發(fā)生有一定的關聯(lián)；泛素化蛋白連接酶抑制劑Bortezomib對野生型