14株海洋放線菌活性產(chǎn)物篩選及菌株MA03抑AFT效能研究.pdf

1、多年來(lái)，黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）對(duì)糧食、中藥材、飼料等的污染是導(dǎo)致家禽家畜體質(zhì)肉質(zhì)下降、人類罹患癌癥等健康問(wèn)題的罪魁禍?zhǔn)?。通過(guò)物理、化學(xué)或生物手段有效防治黃曲霉毒素污染是環(huán)境工作者的重要研究?jī)?nèi)容。其中，黃曲霉毒素的微生物防治法是一種既能最大限度的保持農(nóng)作物等產(chǎn)品品質(zhì)、又能減輕對(duì)環(huán)境副作用的有效手段。
　　以14株分離自黃海海域沉積物的海洋放線菌為材料，分別在淡水和海水環(huán)境下對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，獲得發(fā)酵上清液，通過(guò)Tipc

2、ulture方法，檢測(cè)其抑制寄生曲霉菌絲體生長(zhǎng)和黃曲霉毒素產(chǎn)生的活性，發(fā)現(xiàn)淡水環(huán)境下培養(yǎng)的菌株MA03和MA01對(duì)寄生曲霉菌絲體生長(zhǎng)的抑制率和黃曲霉毒素抑制率均超過(guò)80％，其乙酸乙酯粗提物抑制寄生曲霉菌絲體生長(zhǎng)的IC50值分別為0.275 mg/mL和0.106 mg/mL。
　　此外，本研究還對(duì)上述14個(gè)菌株的其他生理活性進(jìn)行了檢測(cè)。首先，利用MTT方法，檢測(cè)上述菌株發(fā)酵上清液的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)5個(gè)菌株對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有抑制效果，

3、其中菌株MA03對(duì)3株受試腫瘤細(xì)胞系的抑制率均超過(guò)90%，而且，在相同濃度下，其乙酸乙酯粗提物比商品化的抗腫瘤藥物順鉑（DDP）更能高效地抑制腫瘤細(xì)胞集落的形成。其次，還發(fā)現(xiàn)了2株能產(chǎn)生性質(zhì)穩(wěn)定的色素的菌株MA01（產(chǎn)黃色素）和SHXF02-1（產(chǎn)紅色素）。
　　根據(jù)抑黃曲霉毒素的能力，其次考慮抗腫瘤的活性，選擇10株海洋放線菌，通過(guò)分析16S rDNA序列和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，鑒定菌株MA03和MA09屬于擬諾卡氏菌屬（Nocard

4、iopsis），其余8株菌都屬于鏈霉菌屬（Streptomyces）。其中，7個(gè)菌株（包括MA03）含有II型PKS基因。以菌株MA03為主要研究對(duì)象，針對(duì)其形態(tài)特征、生理生化特征以及系統(tǒng)發(fā)育特征進(jìn)行深入分析，確定菌株MA03屬于白色擬諾卡氏菌蔥綠亞種（Nocardiopsis prasina）。
　　對(duì)菌株MA03進(jìn)行大量發(fā)酵，獲得60 L發(fā)酵上清液，然后經(jīng)過(guò)硅膠柱層析、薄層層析、高效液相色譜及質(zhì)譜分析，對(duì)其中抑黃曲霉毒素有效成

5、分進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果顯示：海洋擬諾卡氏菌MA03的發(fā)酵液中可能存在春日霉素（Kasugamycin，抗真菌和抗細(xì)菌活性）、Phaeochromycin G（抗腫瘤活性）、1-十三醇（1-Tridecanol，抗菌活性）、手霉素（SW-B，抗真菌活性）、燼灰紅霉素（Cinerubin，抗腫瘤和抗菌活性）、紫紅菌素A（Griseorhodin A，抗菌活性）、Cylopentadecanone（4-methyl）（活性未知）、Nocaras

6、in C（抗腫瘤和抗菌活性）、Daryamide C（抗腫瘤和抗真菌活性）、Brasiliquinone B（抗菌和抗腫瘤活性）和甲基鼠李素（Rhamnazin，抗氧化活性）。該結(jié)果揭示了海洋擬諾卡氏菌MA03高效的抑黃曲霉毒素和抗腫瘤活性的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)，也表明該菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的生理活性具有多樣性。
　　本研究對(duì)菌株MA03發(fā)酵上清液進(jìn)行了抗氧化能力檢測(cè)，結(jié)果顯示該菌株具有較強(qiáng)的抗氧化作用，因此MA03極有可能產(chǎn)生了Rhamna

7、zin等具有抗氧化活性的化合物。糧食儲(chǔ)藏實(shí)驗(yàn)結(jié)果則證實(shí)菌株MA03發(fā)酵液粗提物能夠有效抑制寄生曲霉對(duì)花生和大米的侵染，強(qiáng)烈抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生，作用效果強(qiáng)于常用防霉劑雙乙酸鈉。
　　對(duì)菌株MA03所產(chǎn)纖維素酶的活性檢測(cè)結(jié)果顯示該酶能作用于甘薯渣等多種底物，且酶活力較高、穩(wěn)定性良好。因此，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)以及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，確定菌株MA03在以高氏一號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的條件下產(chǎn)抑黃曲霉毒素有效

8、成分的優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：玉米淀粉1%、硫酸銨0.4%、MgSO4·7H2O0.05%、NaCl0.05%、K2HPO40.05%、FeSO4·7H2O0.001%以及海水含量0.6%，濃度初始pH7.0。接種量為4%。優(yōu)化培養(yǎng)條件為：發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間為12 d。在以甘薯渣為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的條件下，將響應(yīng)面法優(yōu)化得到菌株MA03的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：海水含量0.64%，硫酸銨濃度0.347%，接種量8.44%，甘薯渣濃度3%，蔗糖濃度2%，

9、硫酸鎂濃度0.1%，初始pH8.5，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間10 d。后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所獲得的抑制效果與預(yù)測(cè)值接近。
　　本研究從14株海洋放線菌中篩選出了擬諾卡氏菌蔥綠亞種MA03，該菌株具有強(qiáng)烈的抑制寄生曲霉菌絲體生長(zhǎng)及其所產(chǎn)黃曲霉毒素積累的作用，而且能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗氧化和產(chǎn)生纖維素酶。菌株MA03所產(chǎn)的抑黃曲霉毒素有效成分包含多種活性化合物，因此其生理活性具有多樣性。綜上所述，海洋擬諾卡氏菌MA03在黃曲霉毒素的微生物防