細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)高光學(xué)純?nèi)樗釂误w的機(jī)理研究.pdf

1、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)是近年來分離獲得能夠高效發(fā)酵合成L-乳酸的耐熱生產(chǎn)菌，所產(chǎn)L-乳酸光學(xué)純度最高可達(dá)99.8％。由于該菌基因工程操作上的限制，目前關(guān)于該菌產(chǎn)高光學(xué)純L-乳酸機(jī)理方面的研究還不是很透徹。本研究在完成該菌全基因組測(cè)序及注釋的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)可能有三個(gè)與乳酸代謝相關(guān)的酶:2個(gè)NAD依賴型L-乳酸脫氫酶(L-LDH)，和1個(gè)NAD依賴型D-乳酸脫氫酶(D-LDH)。本實(shí)驗(yàn)以D-乳酸生產(chǎn)菌菊糖芽

2、孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus）為對(duì)照菌株，通過體外異源表達(dá)LDH的酶學(xué)性質(zhì)分析和野生菌體內(nèi)LDH的酶學(xué)性質(zhì)研究、結(jié)合基因轉(zhuǎn)錄水平和基因敲除技術(shù)等功能基因組學(xué)分析手段，初步闡明了凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)高光學(xué)純L-乳酸的機(jī)理。
　　1、本文分析比較了B.coagulans和S.inulinus中乳酸代謝關(guān)鍵酶的體外異源表達(dá)酶學(xué)性質(zhì)。雖然在兩菌中都檢測(cè)到L-LDH和D-LDH的催化活性。但在B.coagula

3、ns中D-LDH的催化活性遠(yuǎn)低于L-LDH，且D-LDH的Km值(4.10±0.20)高于L-nLDH(3.73±0.19)，Vmax值(20.27±1.80)低于L-nLDH(50.446±1.430)，說明L-nLDH對(duì)丙酮酸的親和性較強(qiáng)，催化活性較高。對(duì)照菌株S.inulinus中D-LDH的催化活性遠(yuǎn)高于L-LDH。來源于兩株菌的LDHs活力的差異，初步說明兩菌分別產(chǎn)高光學(xué)純L-乳酸和D-乳酸的原因。
　　2、比較兩菌乳酸

4、代謝關(guān)鍵酶的體內(nèi)酶學(xué)性質(zhì)。粗酶液Native-Page顯示B.coagulans體內(nèi)只有L-nLDH的活性，而S.inulinus只有D-nLDH的活性。同時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)了兩菌不同發(fā)酵時(shí)期乳酸代謝關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，B.coagulans在發(fā)酵各個(gè)時(shí)期ldhL的轉(zhuǎn)錄水平均大于ldhD，S.inulinus中只檢測(cè)到ldhD的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)兩菌中乳酸代謝關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平均是對(duì)數(shù)期最高，衰亡期期最低。進(jìn)一步闡明了兩菌

5、分別產(chǎn)高光學(xué)純L-乳酸和D-乳酸的原因。
　　3、結(jié)合基因工程技術(shù)敲除B.coagulans中nldhL基因，根據(jù)發(fā)酵產(chǎn)物分析代謝途徑。利用含熱敏型復(fù)制子pSH71的敲除質(zhì)粒pMH77敲除體系，敲除了B.coagulans中l(wèi)dhL2，發(fā)酵結(jié)果顯示，與原始菌相比生長(zhǎng)量OD值較低，并有少量乙酸產(chǎn)生，但生產(chǎn)L-乳酸水平及光學(xué)純度均無明顯差別，說明該基因并非B.coagulansL-乳酸生產(chǎn)的關(guān)鍵基因。進(jìn)而敲除B.coagulans中l(wèi)

6、dhL1，發(fā)酵結(jié)果顯示B.coagulans△ldhL1△ldhL2完全失去L-乳酸合成能力，發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜?、乙醇、甲酸等其他有機(jī)酸，說明L-LDH1是B.coagulans體內(nèi)起主要作用的L-LDH。最后，將主要基因ldh1回補(bǔ)到雙敲除菌株B.coagulans△ldhL1△ldhL2中，發(fā)酵結(jié)果顯示，回補(bǔ)菌生產(chǎn)L-乳酸功能、水平及光學(xué)純度基本回復(fù)到野生型狀態(tài)。同時(shí)配合活性染色檢驗(yàn)原始菌和各突變株體內(nèi)nLDH的活性，結(jié)果顯示，只有