羥乙基纖維素的接枝改性及其用于蛋白質(zhì)和DNA分離的研究.pdf

1、毛細(xì)管電泳(CE)是分析帶電生物大分子如蛋白質(zhì)和DNA等最重要的技術(shù)之一。它具有分離效率高、分離速度快、樣品和試劑消耗量少和易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的特性。在毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)時(shí)，由于毛細(xì)管內(nèi)表面的硅羥基解離(pH>3)形成帶負(fù)電的吸附點(diǎn)，使管壁對(duì)帶正電荷的堿性蛋白質(zhì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸附，導(dǎo)致蛋白質(zhì)信號(hào)峰拖尾、峰形展寬、分離效率與遷移時(shí)間的重復(fù)性下降，甚至形成不可逆吸附使分離無(wú)法進(jìn)行。解決蛋白質(zhì)在毛細(xì)管壁上吸附的有效辦法之一就是對(duì)毛細(xì)管電泳柱進(jìn)行涂覆

2、。毛細(xì)管涂層的形成大致可分為兩類：共價(jià)鍵合和物理吸附。共價(jià)鍵合涂層穩(wěn)定性較好但制作工藝麻煩；物理吸附方法既簡(jiǎn)便易行又具有較高穩(wěn)定性，并且涂層再生能力強(qiáng)，因而備受青睞。 在毛細(xì)管電泳分離雙鏈DNA(dsDNA)時(shí)，篩分介質(zhì)需同時(shí)具有高篩分能力和自涂覆能力。目前，無(wú)膠篩分介質(zhì)(即非交聯(lián)的高分子溶液)中，高分子量線形聚丙烯酰胺(LPA)具有篩分能力強(qiáng)、讀出長(zhǎng)度長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。但是，高分子量LPA溶液的粘度很高而且沒(méi)有自涂覆能力。與之不同的是

3、，聚N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)具有極好的自涂覆能力，但篩分能力較弱。如何研制一種兼具高篩分能力和自涂覆能力的高分子溶液介質(zhì)是DNA高效分析的一個(gè)重要課題。在均聚物溶液介質(zhì)很難同時(shí)滿足所有篩分要求時(shí)，人們?cè)O(shè)計(jì)合成了一系列共聚物來(lái)替代均聚物作為DNA的篩分介質(zhì)。共聚物不僅可以綜合不同單體的各種令人滿意的性能，還可以獲得一些均聚物所不具備的特殊性能，因此就有可能通過(guò)適當(dāng)調(diào)節(jié)分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成而得到優(yōu)良的綜合性能。 本論文的目的

4、是對(duì)天然高分子羥乙基纖維素(HEC)進(jìn)行接枝改性，在保持主鏈HEC高親水性和篩分能力的同時(shí)，根據(jù)不同的分離目的，來(lái)合成不同功能的接枝聚合物，主要工作如下： 1.羥乙基纖維素接枝改性聚合物的合成與表征。 采用硝酸鈰銨(CAN)在酸性溶液中發(fā)生氧化還原反應(yīng)合成了羥乙基纖維素接枝聚N，N-二甲基丙烯酰胺(HEC-g-PDMA)和羥乙基纖維素接枝聚甲基丙烯酸N，N-二甲氨基乙酯(HEC-g-PDMAEMA)兩種接枝聚合物。該合成

5、方法操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)品后處理簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)成本較低，并分別用核磁共振(1H NMR)和紅外光譜(FTIR)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了表征?！　?.HEC-g-PDMA在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用。 HEC-g-PDMA中主鏈HEC和側(cè)鏈PDMA均對(duì)毛細(xì)管具有涂覆作用，特別是接枝上的PDMA鏈段，PDMA良好的疏水性能使得聚合物涂層具有很好的穩(wěn)定性，在起到穩(wěn)定和抑制電滲流作用的同時(shí)，在pH=3～6范圍內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)三種堿性蛋白質(zhì)細(xì)胞色素C (Cytochro

6、me C)、溶菌酶(Lysozyme)和核糖核酸酶A(Ribonuclease A)的高效分離，分離的理論塔板數(shù)達(dá)到105以上。不同接枝密度的HEC-g-PDMA表現(xiàn)出不同的蛋白質(zhì)分離性能，其中接枝密度最高的HEC-g-PDMA-3具有最高的分離效率，但是分離時(shí)間稍長(zhǎng)。此外，還利用石英晶體微天平(QCM)定量的表征了HEC-g-PDMA的抗蛋白質(zhì)吸附性能?！?3.HEC-g-PDMA在dsDNA分離中的應(yīng)用。 HEC-g

7、-PDMA在作為聚合物涂層應(yīng)用于毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)的同時(shí)，因?yàn)镠EC和PDMA都具有很好的篩分性能，而接枝上的PDMA還有很好的涂覆性能，起到穩(wěn)定和抑制電滲流的作用，所以HEC-g-PDMA能應(yīng)用于dsDNA的分離。在對(duì)Ф×174/HaeⅢ digest樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離實(shí)驗(yàn)中，詳細(xì)研究了聚合物溶液濃度、聚合物接枝密度和分離電壓對(duì)dsDNA分離性能的影響。在相同濃度條件下，其中最低接枝密度的HEC-g-PDMA-1對(duì)dsDNA有最

8、高的分離度，但是聚合物溶液粘度也最大、分離時(shí)間也最長(zhǎng)?！　?.HEC-g-PDMAEMA在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用。 在pH=3～8的條件下，考察了HEC-g-PDMAEMA涂層對(duì)蛋白質(zhì)的分離性能。HEC-g-PDMAEMA中的PDMAEMA鏈段具有pH值敏感性，在低pH值下發(fā)生質(zhì)子化，因此通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖溶液pH值，可以改變PDMAEMA鏈段所帶正電荷數(shù)量，同時(shí)還可通過(guò)調(diào)節(jié)主鏈與支鏈的比例來(lái)調(diào)節(jié)整條聚合物的親水性。這對(duì)毛細(xì)管電泳分離堿