從藍(lán)細(xì)菌光敏色素分子設(shè)計出新型PAS-GAF類遠(yuǎn)紅色熒光蛋白生物探針.pdf

1、藍(lán)藻中有許多類似于細(xì)菌光敏色素和藍(lán)細(xì)菌光敏色素的感光受體，能夠結(jié)合藻膽色素產(chǎn)生熒光。藻膽色素類熒光蛋白之間存在高效的能量傳遞，熒光發(fā)射光譜涵蓋了可見光區(qū)至近紅外區(qū)域，斯托克斯位移大，能夠開發(fā)成良好的熒光蛋白類生物標(biāo)記。來源于念珠藻屬Nostoc sp.PCC7120的細(xì)菌光敏色素AphB有PAS、GAF兩個結(jié)構(gòu)域，其中PAS結(jié)構(gòu)域的17位Cys與生色團四吡咯環(huán)A環(huán)上的C3共價偶聯(lián)， GAF結(jié)構(gòu)域上的α-螺旋與β-折疊相互作用形成包裹色素

2、的“口袋”，把膽綠素緊緊的“鎖定”在脫輔基蛋白內(nèi)。在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)的AphB脫輔基蛋白能夠與膽綠素自催化結(jié)合，形成的全蛋白有微弱的熒光，存在Pr態(tài)和Pfr態(tài)的光可逆變化性質(zhì)。重組色素蛋白的最大吸收峰為697nm，最大熒光為721nm，剛好處于650nm-950nm的哺乳動物細(xì)胞的近紅外光學(xué)成像窗口內(nèi)，能夠改造成為具有光控開關(guān)效應(yīng)的近紅外熒光蛋白類生物探針。
　　根據(jù)文獻(xiàn)中已經(jīng)報道的對來自細(xì)菌光敏色素的近紅外熒光蛋白有重要影響的氨

3、基酸保守位點，對 AphB進(jìn)行了定點突變。定點突變得到的所有突變體中， AphB(7-321D207T/I208V/A288V)對光的穩(wěn)定性強，不易發(fā)生熒光漂泊現(xiàn)象。與野生型相比熒光量子產(chǎn)率提高了2.2倍(Φ=0.05)，主要組分的熒光壽命提高了1.2倍(τ1=0.57ns)，摩爾消光系數(shù)也有一定的提高(ε=70000 M-1cm-1)。同時發(fā)現(xiàn)，D207位突變成甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、組氨酸和苯丙氨酸的五個突變體中，D207A的光可逆

4、變化性質(zhì)最為明顯，D207F時色素蛋白幾乎不存在光可逆變化效應(yīng)。可見，隨著該位點的空間位阻的增大色素蛋白的光可逆變化越不明顯。
　　為了進(jìn)一步提高色素蛋白的熒光量子產(chǎn)率和摩爾消光系數(shù)，在上述定點突變的基礎(chǔ)上，通過EP-PCR和DNA Shuffling技術(shù)對AphB進(jìn)行了隨機突變構(gòu)建突變體文庫。經(jīng)過12輪隨機突變，篩選3.0×106個單克隆轉(zhuǎn)化子，得到了50個正向突變體和1個特殊突變體，并按照熒光量子產(chǎn)率由高到低的順序，分別命名為

5、PAS-GAF-X（X：序列號）。所得的50個正向突變體中，大部分突變體的最大吸收峰位于695nm，最大熒光峰位于720nm，Stokes shift為24nm。而特殊突變體PAS-GAF-37的最大吸收峰為606 nm，有649 nm和712 nm兩個熒光峰，熒光量子產(chǎn)率為0.031。篩選得到的突變體中，有3個突變體的摩爾消光系數(shù)提高到了9.2×104 M-1cm-1，有9個突變體熒光量子產(chǎn)率超過了0.057，有20個突變體主要組分的

6、熒光壽命延長到了0.60ns。突變體PAS-GAF-51的Stokes shift最大，為28nm，相反突變體PAS-GAF-52的Stokes shift最小，為21nm。光譜顯示，當(dāng)重組色素蛋白吸收小于696nm時，其最大熒光峰小于720nm，反之亦然，且突變體的最大吸收和熒光峰越往藍(lán)偏移，對應(yīng)的熒光量子產(chǎn)率越高，其主要組分的熒光壽命也越長。
　　利用SWISS-MODEL Sever同源建模在線軟件，以RpBphP2(PDB

7、:4E04)的晶體結(jié)構(gòu)為模板得到了AphB蛋白質(zhì)分子的三維空間模型。根據(jù)模擬得到的蛋白質(zhì)分子的三維模型，可以看出脫輔基蛋白上與色素相鄰的Asp207、Ile208、His260、Tyr263、Ala288和Met174位在維持色素蛋白正確的空間構(gòu)象中發(fā)揮重要作用。His260位于BV色素C環(huán)的正上方，His的咪唑環(huán)與色素四吡咯環(huán)的C環(huán)在空間上重疊。260位組氨酸突變成酪氨酸使色素周圍環(huán)境異構(gòu)化，導(dǎo)致色素蛋白的光譜發(fā)生顯著的變化。