基于多肽功能化聚甲基丙烯酸構(gòu)建高靈敏蛋白酶檢測材料.pdf

1、蛋白酶是生物體內(nèi)一種可以分解蛋白質(zhì)或多肽的一種酶。蛋白酶廣泛存在于各種生物體中，參與并調(diào)控食物消化、血液凝結(jié)、細胞凋亡等多種生理過程。研究表明，包括心血管疾病、癌癥、阿茲海默癥等在內(nèi)的多種疾病都會導(dǎo)致患者血清中的某些蛋白酶含量異常升高。目前，蛋白酶標(biāo)志物的檢測包括高效液相色譜(HPLC)、質(zhì)譜(MS)等方法，但是上述方法需要使用復(fù)雜、昂貴的儀器，不便實現(xiàn)床邊檢測(Point-of-care test，POCT)。因此，開發(fā)一種可以快速、

2、高靈敏檢測蛋白酶的新型材料對心血管疾病、癌癥等重大疾病的早期診斷具有重要意義。
　　本論文的第一部分，通過表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(SI-ATRP)在二氧化硅納米粒子表面接枝聚甲基丙烯酸(PMAA)聚合物刷并對其進行多肽功能化修飾(CGGGGGRGGK-FITC或CGGGGGWGGK-FITC)。當(dāng)聚合物刷上的多肽底物被蛋白酶水解，釋放出熒光標(biāo)記的多肽殘基(GGK-FITC)，經(jīng)過離心、超濾分離后用熒光顯微鏡檢測反應(yīng)液中的熒光強

3、度，從而定量表征溶液中蛋白酶的最低檢測極限(LOD)及其酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)(Km，vmax，kcat等)。二氧化硅納米粒子上PMAA聚合物刷和多肽的接枝量可以通過ATRP反應(yīng)中的單體濃度調(diào)控。由于PMAA聚合物刷具有三維空間結(jié)構(gòu)，因此在后續(xù)多肽功能化修飾中多肽的接枝密度（22.4肽鏈/nm2）顯著高于自組裝單分子層(SAM)上修飾的多肽接枝密度（約0.1肽鏈/nm2）。以上述多肽功能化的PMAA聚合物刷為底物，該材料在Tris緩沖溶液(

4、pH8.0)與牛血清中檢測胰蛋白酶的LOD可以分別達到1.4pM和2.6nM。該多肽功能化PMAA聚合物刷用于蛋白酶檢測具有較好的普適性。通過設(shè)計多肽的氨基酸序列(KKGGPLGLAGGK-F ITC)并用其進行PMAA的功能化修飾，該材料可以用來檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)，其LOD為1.1pM。
　　上述多肽功能化PMAA聚合物刷可以用于高靈敏蛋白酶檢測，但是該方法依賴離心、超濾過程將蛋白酶水解的多肽殘基與母液分離，進

5、而進行熒光表征。上述分離、純化過程限制了該方法在床邊檢測(POCT)中的應(yīng)用。為了解決這一問題，本論文的第二部分首先在玻璃基板表面構(gòu)建聚丙烯酰胺凝膠微陣列和聚乙二醇(PEG)微柱環(huán)，當(dāng)多肽功能化PMAA聚合物刷上的多肽底物被蛋白酶水解，釋放出的多肽殘基(GGK-FITC)可以進入聚丙烯酰胺凝膠微陣列的高分子網(wǎng)孔，未被蛋白酶水解的多肽仍留在聚合物刷上，不會進入到聚丙烯酰胺凝膠網(wǎng)孔中，從而實現(xiàn)多肽殘基的分離與蛋白酶檢測。該方法在Tris緩沖

6、溶液(pH8.0)與牛血清中檢測胰蛋白酶的LOD分別為157pM和243nM。該方法在Tris緩沖溶液中(pH8.0)檢測MMP-2和MMP-9的LOD分別為1.67nM和1.22nM。由于被蛋白酶水解的多肽殘基在聚丙烯酰胺凝膠微陣列中會伴隨芯片的清洗過程擴散逸出，造成上述方法檢測蛋白酶的LOD并不理想。為了解決這一問題，在聚丙烯酰胺的高分子鏈段中引入β-環(huán)糊精(β-CD)，并在多肽底物上修飾金剛烷(Ad)官能團，通過Ad/CD超分子相