掃描電化學(xué)顯微術(shù)結(jié)合微反應(yīng)器的單細(xì)胞分析.pdf

1、本文共分兩部分：1．微反應(yīng)器的構(gòu)建、表征及結(jié)合掃描電化學(xué)顯微術(shù)(Scanning Electrochemical Microscopy，SECM)的應(yīng)用：II．掃描電化學(xué)顯微術(shù)結(jié)合微反應(yīng)器定量測定人單個(gè)中性粒細(xì)胞中的過氧化物酶(PO)。 第一部分我們制作了一種適于SECM現(xiàn)場電化學(xué)檢測用的微反應(yīng)器，并用該微反應(yīng)器對辣根過氧化物酶(HRP)活性進(jìn)行了測定。首先在表面平整的有機(jī)玻璃上構(gòu)建一個(gè)微池，將IIRP及其底物H<,2>O和H<

2、,2>O<,2>用自制微量加樣器加入到微池中孵育，然后在微池口上方推片澆筑多孔硝酸纖維素膜，從而制得微反應(yīng)器。將帶有HRP和底物H<,2>O、H<,2>O<,2>的微反應(yīng)器放入含PBS、H<,2>O、H<,2>O<,2>的電解池中，直徑20 um的Au 工作電極作為SECM的探頭插入上述電解池的溶液中，并逼近到微反應(yīng)器，在微反應(yīng)器上掃描。通過檢測擴(kuò)散出微反應(yīng)器的酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物BQ的還原電流而測定HRP的量。我們對電極電位，底物的濃度，

3、電化學(xué)檢測的重現(xiàn)性，孵育時(shí)間和微池直徑及深度等幾種因素進(jìn)行了研究，確定了HRP檢測的最佳實(shí)驗(yàn)條件為：pH7.4的PBS緩沖溶液；H<,2>O的濃度為2.00x10<'-3>mol/L，H<,2>O<,2>的濃度為2.00x 10<'-3>mol/L：探頭電位為-0.3 V(vs.Ag/AgCl)：孵育20 min．；電極為直徑20 um的金圓盤電極；微池直徑為200um、深度為550 um。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，HRP的線性檢測范圍在7.5

4、0×10<'9> U-5.63×10<'-7>U之間，檢測限可達(dá)到3.7x10<'9> U。同以往方法相比，本方法中待測酶在溶液中處于游離狀態(tài)，可以最大限度保持其活性。并且本實(shí)驗(yàn)中采用孵育和推片澆膜的措施，大大提高了信號靈敏度，另外，此方法中沒有氧的干擾和電極被污染的情況。 第二部分我們利用微反應(yīng)器對中性粒細(xì)胞提取液及單個(gè)中性粒細(xì)胞中的過氧化物酶(PO)進(jìn)行了測定。為使細(xì)胞溶膜更方便，細(xì)胞先用Dig穿孔，然后用自制細(xì)胞加樣器