藍(lán)藻生物燃料中典型萜類物質(zhì)的代謝工程研究.pdf

1、世界人口增長(zhǎng)和工業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展對(duì)能源的需求越來(lái)越大，生物燃料作為一種可替代傳統(tǒng)燃料的環(huán)境友好型可再生能源受到了人們的關(guān)注。目前美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)對(duì)生物燃料的重視程度和研究成績(jī)都遠(yuǎn)領(lǐng)先于中國(guó)，主要的研究方向是以光合微生物為平臺(tái)生產(chǎn)人們需要的生物燃料和高價(jià)值產(chǎn)品。藍(lán)藻是作為第三代生物燃料的重要原料，利用太陽(yáng)能固定CO2轉(zhuǎn)化成各種形式的生物能，極具應(yīng)用前景。而萜類物質(zhì)家族龐大，能作為傳統(tǒng)燃料的替代品，還是應(yīng)用廣泛的高價(jià)值化合物。因此，如何以藍(lán)

2、藻為代謝平臺(tái)生產(chǎn)萜類物質(zhì)是這一領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，然而現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)關(guān)于這部分的研究仍較空白。本實(shí)驗(yàn)以藍(lán)藻為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，在了解其MEP代謝路徑的基礎(chǔ)上，通過(guò)代謝工程調(diào)控方法，在藍(lán)藻Cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC7942表達(dá)高效的外源關(guān)鍵萜類合成酶基因（檸檬烯合成基因和法呢烯合成酶基因），在藍(lán)藻Synechocystis sp. PCC6803中驗(yàn)證鯊烯環(huán)化酶基因敲除后的產(chǎn)物累計(jì)，以此探索增

3、強(qiáng)或阻礙關(guān)鍵酶的表達(dá)對(duì)藍(lán)藻細(xì)胞萜烯產(chǎn)物累積和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。目標(biāo)產(chǎn)物分別包括單萜－檸檬烯，倍半萜－法尼烯和三萜-鯊烯。主要研究結(jié)果如下：
　　1.通過(guò)構(gòu)建含有檸檬烯合成酶基因LS的質(zhì)粒，并成功表達(dá)LS基因，證明了檸檬烯合成酶基因 LS是檸檬烯的合成的關(guān)鍵， Cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC7942具備生產(chǎn)檸檬烯的能力。且不同的啟動(dòng)子對(duì)相同基因的表達(dá)有影響，同時(shí)具有Ptrc啟動(dòng)子和

4、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）的菌株產(chǎn)量最高，日平均產(chǎn)率達(dá)到53.0μg/L/OD/day，因此要提高產(chǎn)量需要篩選出高效的啟動(dòng)子。
　　2.通過(guò)構(gòu)建含有法呢烯合成酶FS基因的質(zhì)粒，并成功表達(dá)FS基因通，證明了法呢烯合成酶基因FS是法尼烯合成的關(guān)鍵，且藍(lán)藻細(xì)胞PCC7942同樣具備法呢烯合成路徑中必要的原料和酶。
　　3.驗(yàn)證了鯊烯下游鯊烯藿烯環(huán)化酶基因Shc的敲除的確能積累鯊烯，藍(lán)藻突變株 Synechocystis sp. PC