雙光子熒光顯微鏡用于在體小鼠下丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+檢測(cè)的方法學(xué)探討.pdf

1、背景：
　　雙光子熒光顯微鏡成像技術(shù)已經(jīng)被視為一項(xiàng)重要的科學(xué)研究技術(shù)來(lái)探測(cè)細(xì)胞內(nèi)的鈣信號(hào)和細(xì)胞膜電位變化等。隨著技術(shù)改進(jìn)，近幾年這種技術(shù)也可以對(duì)一些麻醉狀態(tài)下的動(dòng)物進(jìn)行在體檢測(cè)。但是，傳統(tǒng)的雙光子熒光顯微鏡的在體熒光成像技術(shù)局限在大腦顱頂皮層的細(xì)胞，不能直接觀測(cè)到大腦深層細(xì)胞和顱底表層。下丘腦腹內(nèi)側(cè)核（ventromedial hypothalamic nucleus，VMH），由于位于顱底淺層，按照以往的實(shí)驗(yàn)方式利用雙光子熒光顯

2、微鏡不可能在體檢測(cè)到VMH的熒光信號(hào)。
　　目的：
　　通過(guò)顱底暴露手術(shù)聯(lián)合雙光子熒光成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)在體記錄VMH區(qū)域神經(jīng)元鈣離子活動(dòng)信號(hào)并研究下丘腦核團(tuán)活動(dòng)規(guī)律。
　　方法：
　　1.加頭件
　　將麻醉小鼠顱頂正中消毒脫毛去皮后黏上鈦合金頭件，并涂上厚厚的牙科水泥將周圍縫隙填滿，以便拍攝時(shí)牢牢固定小鼠。
　　2．監(jiān)測(cè)小鼠主要生理指標(biāo)
　　手術(shù)過(guò)程中用小鼠無(wú)創(chuàng)血氧儀全程監(jiān)測(cè)小鼠各項(xiàng)生理指標(biāo)。其中通

3、過(guò)直腸探針監(jiān)測(cè)體溫，通過(guò)紅外傳感器檢測(cè)心率和血氧飽和度。將小鼠放在加熱墊上并將加熱墊溫度維持在約36°C。
　　3.氣管插管
　　將小鼠仰臥位固定在加熱墊上。在脖子中線做一個(gè)1厘米的切口暴露下頜腺體。然后用止血鉗鈍性分離肌肉直到暴露氣管，將一個(gè)3厘米的橡膠管插入氣管并用無(wú)菌手術(shù)線打結(jié)。
　　4.顱底暴露手術(shù)
　　將彎頭止血鉗尖端緊貼在下頜肌肉上，再將高頻電刀尖端垂直放在血管鉗尖端，從上至下緩慢勻速用雙極電凝燒灼表

4、面血管。用外科手術(shù)剪將兩顆門牙中間剪開一個(gè)小口，再用高頻電刀電切分開小鼠兩顆門牙。
　　用高頻電刀從上往下電切開下頜肌肉，再用舌頭環(huán)切術(shù)去掉小鼠舌頭。用電刀電切小鼠上顎表面，然后用高速顱骨鉆把腔隙磨大（約2.5mm x5.0mm）再把周邊的骨頭磨薄至半透明狀態(tài)，用鑷子小心地從邊緣掀開硬腦膜，去除掉腔隙全部骨頭和硬腦膜。
　　5.注射鈣指示劑
　　通過(guò)熒光標(biāo)記法給小鼠下丘腦腹內(nèi)側(cè)核區(qū)域注射鈣離子指示劑OGB-1，來(lái)追蹤鈣

5、瞬態(tài)變化。注射完后貼上玻片并用1.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖壓住以減小小鼠的肌肉抖動(dòng)和呼吸振動(dòng)對(duì)拍攝平面的影響。
　　6.雙光子熒光顯微鏡下在體成像
　　將注射過(guò)鈣指示劑OGB-1的小鼠固定到雙光子實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用雙光子顯微鏡下掃描VMH區(qū)域，成像深度約為-300~-550μm，拍攝速度為20.4幀／秒（像素為768x768像素）。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立一套小鼠顱底暴露下丘腦核團(tuán)手術(shù)。術(shù)后成活小鼠的生理指標(biāo)包括體溫、

6、血氧飽和度、心率具有普遍特征，均呈隨手術(shù)時(shí)間推移緩慢波動(dòng)回升。
　　2.下丘腦腹內(nèi)側(cè)核區(qū)域自發(fā)鈣活動(dòng)并不一致，在被檢測(cè)的時(shí)間內(nèi)有的呈高頻活動(dòng)，有的低頻活動(dòng)，即使同一個(gè)神經(jīng)元，其活動(dòng)間隔時(shí)間也不相等，自發(fā)鈣活動(dòng)頻率范圍在0.004Hz~0.0204Hz。
　　3.膠質(zhì)細(xì)胞聚集在一起并與血管和神經(jīng)元形成一個(gè)密集的網(wǎng)絡(luò)，而與它相連的其他神經(jīng)元活動(dòng)時(shí)也能同時(shí)誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，說(shuō)明了膠質(zhì)細(xì)胞也具有與神經(jīng)元類似的特性，可能