微型化雙光子顯微鏡及自由活動(dòng)小鼠神經(jīng)成像.pdf

1、課題研究背景：
　　大腦的重要功能之一是對(duì)生物體的行為活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控，而反過(guò)來(lái)，生物體的行為活動(dòng)也直接反應(yīng)大腦的工作狀態(tài)。為了了解大腦，研究者不僅要求在活體狀態(tài)下對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行高分辨率觀(guān)測(cè)，而且也希望生物體在被觀(guān)測(cè)的階段里，能夠進(jìn)行正常的行為活動(dòng)。所以，在成像技術(shù)不斷地提高分辨率和速度等性能的同時(shí)，科學(xué)家們也在積極開(kāi)改進(jìn)和革這些成像技術(shù)手段，使其進(jìn)行成像時(shí)盡可能小的限制被觀(guān)測(cè)對(duì)象的行為活動(dòng)，以求獲得最接近生理狀態(tài)下的大腦活動(dòng)的信息。<

2、br>　　近年來(lái)微型雙光子顯微鏡的發(fā)展為在被研究動(dòng)物自由活動(dòng)下直接觀(guān)察大腦結(jié)構(gòu)和活動(dòng)提供了工具。然而，若要研制出具有實(shí)用價(jià)值的微型雙光子顯微鏡面臨諸多挑戰(zhàn)，其原因在于雙光子成像技術(shù)本身有著苛刻的條件要求：
　　首先，與單光子熒光效應(yīng)相比，雙光子熒光效應(yīng)的發(fā)生概率極小，需要極高峰值功率的飛秒激光作為光源才能得到足有生物成像所需的熒光信號(hào)；其次，飛秒激光的傳輸是一個(gè)復(fù)雜的，非線(xiàn)性光學(xué)效應(yīng)主導(dǎo)的過(guò)程。為了保證飛秒激光的無(wú)畸變傳輸，傳播介

3、質(zhì)有著嚴(yán)格的限制；此外，在一般的生物樣本中，相同平均功率和等效激發(fā)波長(zhǎng)下，一般雙光子所激發(fā)的光子數(shù)比單光子效應(yīng)激發(fā)的光子數(shù)少幾個(gè)數(shù)量級(jí)，所以每次需要把全部的激光都匯聚在一個(gè)微米量級(jí)的點(diǎn)來(lái)提高激發(fā)效率，所以對(duì)光學(xué)系統(tǒng)的光學(xué)性能要求更加苛刻，并且為了得到二維圖像，通常需要通過(guò)逐點(diǎn)掃描的方式進(jìn)行成像。
　　所以針對(duì)上述雙光子成像自身特點(diǎn)，微型雙光子顯微鏡需要需要解決如下幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)難題：
　　1.如何將飛秒激光有效的導(dǎo)入微型顯微鏡

4、；
　　2.如何在微型顯微鏡內(nèi)進(jìn)行掃描/圖像重建；
　　3如何在微型顯微鏡中進(jìn)行高質(zhì)量的激光匯聚，高效激發(fā)雙光子信號(hào)。
　　4.如何有效的對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行收集；
　　5.如何使整個(gè)系統(tǒng)在動(dòng)物劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)仍保持穩(wěn)定；
　　6.在滿(mǎn)足前5項(xiàng)條件下，重量是否足夠輕，以致盡量小地對(duì)動(dòng)物的活動(dòng)造成影響；
　　課題研究目標(biāo)：
　　基于前人對(duì)于微型雙光子顯微鏡研究開(kāi)發(fā)的經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，開(kāi)發(fā)一系列全新的微型雙光子顯微鏡

5、系統(tǒng)，并制定更加完善和穩(wěn)定的自由活動(dòng)小鼠神經(jīng)成像方法。
　　課題研究結(jié)果：
　　首先，本文分需求，制約和配合三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，提出了微型雙光子顯微鏡的設(shè)計(jì)原則。接著，本文詳細(xì)匯報(bào)了本課題所研制的第一代微型雙光子顯微鏡（FHIRM-TPM1.0）。FHIRM-TPM1.0的優(yōu)勢(shì)之處在于：顯微鏡探頭僅重2.15克；具有非常高的時(shí)空分辨率（橫向0.65μm，軸向3.30μm；40Hz）；是世界上目前唯一一款可以高效的進(jìn)行GCamP成像的

6、微型雙光子顯微鏡；能夠?qū)崿F(xiàn)超高速隨機(jī)掃描（random scan）和高達(dá)10,000 Hz的線(xiàn)掃描（line scan）；FHIRM-TPM1.0在實(shí)際的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中展示出了極高的性能和穩(wěn)定性：在小鼠進(jìn)行劇烈的行為活動(dòng)，比如扭動(dòng)頭部或進(jìn)行社交行為時(shí)，仍可以進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)的神經(jīng)元單樹(shù)突棘水平的成像。
　　最后，本文介紹了本人目前在研項(xiàng)目，包括：新一代的微型雙光子顯微鏡；全新的高性能微型成像平臺(tái)—TEACH；Z軸掃描的幾種方案；自適應(yīng)

7、光學(xué)微型系統(tǒng)等
　　結(jié)論：
　　理論方面，歸納了現(xiàn)有微型雙光子的技術(shù)分類(lèi)和特點(diǎn)，指出了各技術(shù)路線(xiàn)中各指標(biāo)存在的制約關(guān)系，提出了微型雙光子顯微鏡的設(shè)計(jì)原則。技術(shù)方面，本課題所研發(fā)的微型雙光子顯微鏡技術(shù)克服了先前限制微型雙光子應(yīng)用的多種障礙，實(shí)現(xiàn)了高時(shí)空分辨率，良好的機(jī)械穩(wěn)定性，以及對(duì)應(yīng)用范圍最廣的指示劑的有效激發(fā)，并進(jìn)一步研制了全新的高性能微型成像平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)方面，實(shí)現(xiàn)了在自由活動(dòng)的動(dòng)物中單突觸水平的長(zhǎng)時(shí)間成像這一科學(xué)家夢(mèng)寐以求