金針菇和杏鮑菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選與分子鑒定.pdf

1、食用菌（Edible fungi）是一類可食用的大型真菌，很多時(shí)候被人們稱為蘑菇。中國有著豐富的食用菌資源，隨著人們健康飲食理念和對食用菌認(rèn)識的加深，國內(nèi)食用菌的消費(fèi)量不斷提高，這也促進(jìn)了其種質(zhì)資源、遺傳育種等基礎(chǔ)研究，近年來分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展并應(yīng)用于食用菌遺傳育種領(lǐng)域。金針菇和杏鮑菇是我國工廠化栽培的主要品種，其基因組測序工作已經(jīng)完成，這將促進(jìn)其分子遺傳學(xué)研究的快速發(fā)展，但在其遺傳轉(zhuǎn)化、雜交育種、菌種的鑒定與保護(hù)研究中還缺乏有效的

2、遺傳標(biāo)記。
　　本研究主要運(yùn)用原生質(zhì)體紫外誘變技術(shù)篩選出金針菇和杏鮑菇的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株，并對其基因型進(jìn)行分子鑒定。進(jìn)一步通過雜交方法創(chuàng)制出尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核菌株，并探討了尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核菌株的部分生物學(xué)性狀。為其應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化、雜交育種、菌種的鑒定與保護(hù)提供了科學(xué)依據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)獲得的主要結(jié)果如下：
　　1.通過原生質(zhì)體單核化，獲得金針菇‘G1’菌株的單核菌株‘DG1-1’（交配型A1B1）和‘DG1-2

3、9’（交配型A2B2），通過對其進(jìn)行5-氟乳清酸的敏感性實(shí)驗(yàn)，得出‘DG1-1’菌株對5-氟乳清酸具有更高的敏感性，在5-氟乳清酸濃度為0.1 g·L-1時(shí)受到明顯抑制，在0.5 g·L-1受到完全抑制。通過原生質(zhì)體紫外致死實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出‘DG1-1’菌株原生質(zhì)體存活率50％的半致死紫外照射時(shí)間為11.38 s，基于此試驗(yàn)結(jié)果選擇12 s作為紫外光誘變原生質(zhì)體的照射時(shí)間。
　　2.對金針菇‘DG1-1’原生質(zhì)體采用功率為10 W的紫

4、外光進(jìn)行垂直距離15 cm照射12 s的誘變處理，共獲得誘變菌株102株。經(jīng)過兩次篩選平板培養(yǎng)基篩選及5次傳代穩(wěn)定試驗(yàn)，最終共獲得3株金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型突變菌株‘NG1-65’、‘NG1-92’和‘NG1-95’。對其進(jìn)行基因型驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)‘NG1-65’和‘NG1-95’的pyrF基因發(fā)生突變，‘NG1-92’的pyrG基因發(fā)生突變。
　　3.將金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單核菌株與交配型親和的正常單核菌株雜交得到3株雜交菌株并進(jìn)行出

5、菇實(shí)驗(yàn)，單孢分離得到金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型單孢菌株，對各雜交菌株的10株單孢菌株進(jìn)行配對自交，獲得38株金針菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核菌株。隨機(jī)選取每個(gè)雜交菌株的單孢自交尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核菌株5株，測量在含有不同尿嘧啶濃度的MM、PDA和木屑培養(yǎng)基上的生長速度，得到低濃度（0.05 mmol· L-1）的尿嘧啶促進(jìn)菌絲生長，高濃度（0.15 mmol· L-1）的尿嘧啶抑制菌絲生長，并對生長速度較快的3株尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核菌株和正常菌株

6、進(jìn)行出菇實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核菌株能夠產(chǎn)生子實(shí)體，但產(chǎn)量明顯降低，并與栽培料中尿嘧啶含量呈正相關(guān)。
　　4.通過原生質(zhì)體單核化技術(shù)獲得杏鮑菇單核菌株‘DX8’（交配型A1B1）與‘DX25’（交配型A2B2），通過對這兩株菌株進(jìn)行5-氟乳清酸的敏感性實(shí)驗(yàn)，得出‘DX8’與‘DX25’菌株對5-氟乳清酸的敏感性無明顯差異，并且在5-氟乳清酸濃度為0.1 g·L-1時(shí)受到明顯抑制，在0.5 g·L-1受到完全抑制。測試計(jì)

7、算出‘DX8’與‘DX25’原生質(zhì)體存活率為50%的半致死率紫外照射時(shí)間分別為6.59 s和6.78 s基于此實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇7s作為紫外光誘變供試杏鮑菇原生質(zhì)體的照射時(shí)間。
　　5.對杏鮑菇‘DX8’與‘DX25’原生質(zhì)體采用功率為10 W的紫外光進(jìn)行垂直距離15 cm照射7 s的誘變處理，獲得‘DX8’的誘變菌株288株和‘DX25’的誘變菌株63株，經(jīng)過兩次篩選平板培養(yǎng)基篩選及5次傳代穩(wěn)定試驗(yàn)，最終得到‘DX8’的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷

8、型菌株1株‘NX1-265’，‘DX25’的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株3株‘NX2-0’、‘NX2-11’和‘NX2-23’。對其進(jìn)行基因型驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)4株尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株的pyrF基因發(fā)生突變。
　　6.所獲得的4株尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株通過回交獲得4株杏鮑菇雜交菌株并進(jìn)行出菇實(shí)驗(yàn)，其中SXN1、SXN3和SXN4收集得到孢子，通過單單自交獲得29株杏鮑菇尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核菌株。隨機(jī)選取每個(gè)雜交菌株的單孢自交尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核菌株5