大豆脂肪酸FAD3轉(zhuǎn)基因水稻的抗冷效應(yīng)及大豆Le4蛋白抗蚜蟲的作用.pdf

1、水稻極易受到低溫和蟲害等的影響而減產(chǎn)，提高水稻的抗低溫和抗蟲能力，一直都是水稻研究的熱點(diǎn)。不飽和脂肪酸含量的提高能夠增強(qiáng)植物對(duì)低溫脅迫的效應(yīng)。豆科凝集素具有凝集細(xì)胞、沉淀多糖和蛋白質(zhì)等獨(dú)特的生理功能，在農(nóng)作物抗蟲中獲得了廣泛的關(guān)注。
　　本實(shí)驗(yàn)前期獲得了不飽和脂肪酸含量提高的轉(zhuǎn)大豆FAD3水稻，本文通過表型分析、抗冷生理生化指標(biāo)檢測(cè)、基因表達(dá)分析等方法比較低溫脅迫下大豆FAD3轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的差異。同時(shí)利用原核表達(dá)及蛋白純

2、化技術(shù)，獲得了豆科凝集素Le4蛋白，并分析了Le4蛋白的殺蟲效應(yīng)。
　　其主要結(jié)果如下：
　　1.大豆FAD3轉(zhuǎn)基因水稻的抗冷效應(yīng)分析
　　1）利用PCR技術(shù)結(jié)合潮霉素篩選獲得了GmFAD3轉(zhuǎn)基因純和株系（編號(hào)：TransFAD3）。在15℃低溫條件下，觀察并統(tǒng)計(jì)了TransFAD3和野生型植株的種子的萌發(fā)率，結(jié)果表明TransFAD3種子的低溫萌發(fā)率明顯高于野生型，約為野生型的7倍。進(jìn)一步對(duì)低溫下TransFAD3表

3、型進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)4℃低溫處理后，野生型水稻葉片萎蔫現(xiàn)象明顯比TransFAD3嚴(yán)重，常溫恢復(fù)生長(zhǎng)7天后，TransFAD3轉(zhuǎn)基因水稻幼苗大部分恢復(fù)生長(zhǎng)，其存活率遠(yuǎn)高于野生型對(duì)照，約為野生型的4.3倍。
　　2）對(duì)不同低溫條件下TransFAD3和野生型水稻生理生化指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，在10℃低溫脅迫下，TransFAD3植株中的MDA含量低于野生型，最低約為野生型的75.5％，TransFAD3植株中脯氨酸含量明顯高于野生

4、型，最高約為野生型的1.31倍，TransFAD3植株中SOD、POD及CAT活性也高于野生型水稻，最高分別為3.33倍、2.38倍、1.61倍。在4℃低溫脅迫下，TransFAD3植株中的MDA含量低于野生型，最低約為野生型的88.1%，TransFAD3植株中脯氨酸含量明顯高于野生型，最高約為野生型的1.56倍，TransFAD3植株中SOD、POD及CAT活性也高于野生型水稻，最高分別為2.95倍、1.95倍、2.4倍。
　

5、　2.豆科凝集素Le4蛋白的抗蟲性分析
　　1）將構(gòu)建好的pET28a-Le4質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)，加入IPTG誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)物濃度等表達(dá)條件的優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)16℃誘導(dǎo)20h，能在上清中獲得可溶狀態(tài)的Le4蛋白，利用鎳柱從上清中純化了部分Le4蛋白。
　　2）通過涂抹法將純化的Le4上清蛋白和對(duì)照組均勻涂抹到小麥葉片上，結(jié)果表明，對(duì)照組葉片上的蚜蟲數(shù)目顯著高于涂抹了Le4蛋白的小麥葉片，約為3.6