好氧反硝化細菌的分離鑒定及其應用研究.pdf

1、反硝化是硝酸鹽或亞硝酸鹽被還原成N<,2>O或N<,2>的過程。細菌反硝化包括4個還原步驟，分別由硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶催化完成。傳統(tǒng)理論認為，細菌的反硝化是一個嚴格的厭氧過程。然而，二十世紀80年代，Robertson等人好氧反硝化細菌的發(fā)現(xiàn)，以及隨后人們對好氧反硝化機制的研究突破了傳統(tǒng)認識，為廢水處理工作者設計處理工藝提供了新的理論和思路，具有廣泛的應用前景。研究表明，自然界蘊藏著豐富的好氧反硝化

2、細菌，可在不同的環(huán)境(灌渠、水池、土壤以及活性污泥)中大量分離?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多菌屬如產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、副球菌屬(Paracoccus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)都存在好氧反硝化現(xiàn)象。 本文從武漢市郊某紡織廠排污口以及武漢市郊某養(yǎng)豬廠排污口篩選分離出兩株脫氮能力較強的菌株，分別命名為HS-043、HS-047。對這兩株新篩選的細菌以及實驗室原有細菌HS-03的反硝化能力的進一步研究表明：在特定的培養(yǎng)基

3、中，三株細菌均具有較強的反硝化能力，能分別在12-18小時內(nèi)將10mM的硝酸鹽完全去除。在降解含氮廢水中過程中，添加與不添加、添加不同的碳源以及不同濃度的Fe<'2+>和MoO<,4><'2->對菌株的降解能力都有很大的影響。在只添加碳源(丁二酸鈉)時，三株細菌能分別降解或共同降解含氮廢水中10 mM的硝酸鹽10-40％。細菌HS-03與真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)組合，能在6天內(nèi)降解含氮廢水中10mM的硝酸鹽98

4、％以上。細菌HS-03與真菌米曲霉協(xié)同反硝化的效率高于兩者單獨的反硝化率。在同時添加碳源以及微量的Fe<'2+>和MoO<，4><'2->情況下，菌株降解含氮廢水的能力有很大幅度的提高。在添加100 mM Fe<'2+>以及l(fā) nM MoO<,4><'2->的情況下，細菌HS-03、HS-043和HS-047以丁二酸鈉或乙醇為碳源時，能分別在11-24小時內(nèi)將廢水中10 mM的硝態(tài)氮去除98％以上。對三株細菌的生理生化鑒定、分子水平的鑒

5、定分析以及系統(tǒng)發(fā)育分析表明：細菌HS-03與HS-047均屬于假單胞菌屬中的不同種，分別屬于P.stutzeri(施氏假單胞菌)和P.pseudoalcaligenes(類產(chǎn)堿假單胞菌)，細菌HS-043屬于Delftiaacidovorans(食酸叢毛單胞菌)。細菌HS-03與HS-047的親緣性較高，而細菌HS-043與細菌HS-03和HS-047的親緣性相對較低。到目前為止，食酸叢毛單胞菌關于其降解硝酸鹽、亞硝酸鹽的特性國內(nèi)外幾乎

6、從未見報道。對三株細菌降解含氮廢水的研究，為高效、經(jīng)濟地處理含氮廢水提供了切實可行的技術資源和理論基礎。并為生物快速脫氮凈化水處理提供了有用的菌源。三株細菌分別篩選于不同的自然環(huán)境，對三株細菌降解廢水能力的應用研究，將有利于合理開發(fā)利用自然資源，保護自然生態(tài)環(huán)境。 一氧化二氮(Nπ<,2>O)的排放是導致目前全球氣候變暖和大氣平流層臭氧損耗的主要因素。一氧化二氮給生態(tài)環(huán)境和人們身體健康帶來嚴重危害，已引起各國科學家們對它的重視

7、。開展對一氧化二氮還原酶的研究，具有重要的實際意義。本文對反硝化細菌一氧化二氮還原酶的結(jié)構(gòu)基因nosZ進行了克隆表達研究。以細菌P .stutzeri HS-03核DNA為模板，根據(jù)Genbank中的p.stutzeri IIOS基因序列(登記序列號為M22628)設計引物進行PCR擴增，得到約1500 bp的片斷。將PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與質(zhì)粒pMDl8-T連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。經(jīng)BamHI和HindIⅡ酶切鑒定證實構(gòu)建成功。且經(jīng)kpn I

8、酶切鑒定出有目的片段插入方向不同的兩種重組質(zhì)粒。選擇正確方向的克隆經(jīng)BamHI和HindIII消化后與質(zhì)粒pET28連接構(gòu)建重組表達質(zhì)粒。經(jīng)BamHI和HindII酶切鑒定證實構(gòu)建成功。將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中表達。經(jīng)IPTG分別誘導后，重組質(zhì)粒pET28-nosZ在約為21 KD處有較大的表達量。將重組質(zhì)粒pET28-nosZ測序后得到目的片斷的全序列，與Genbank中序列登記號為M22628的施氏假單胞菌P。stut