好氧反硝化細(xì)菌應(yīng)用研究及nosZ基因克隆表達(dá).pdf

1、反硝化是硝酸鹽或亞硝酸鹽被還原成N2O或N2的過程。細(xì)菌反硝化包括4個(gè)還原步驟，分別由硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶催化完成。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，細(xì)菌的反硝化是一個(gè)嚴(yán)格的厭氧過程。然而，二十世紀(jì)80年代，Robertson等人對(duì)好氧反硝化細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)以及隨后人們對(duì)好氧反硝化機(jī)制的研究突破了傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)，為廢水處理工作者設(shè)計(jì)處理工藝提供了新的理論和思路，具有廣泛的應(yīng)用前景。研究表明，自然界蘊(yùn)藏著豐富的好氧反硝化細(xì)菌，可在不

2、同的環(huán)境(灌渠、水池、土壤以及活性污泥)中大量分離。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多菌屬如產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、副球菌屬(Paracoccus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)都存在好氧反硝化現(xiàn)象。 從湖北省洪湖市篩選分離出兩株脫氮能力較強(qiáng)的菌株，分別命名為HS-N24、HS-N25。對(duì)這兩株新篩選的細(xì)菌以及實(shí)驗(yàn)室原有可降解甲基對(duì)硫磷細(xì)菌HS-MP12、HS-MP13反硝化能力的進(jìn)一步研究表明：在特定的培養(yǎng)基中，四株細(xì)菌均具有

3、較強(qiáng)的反硝化能力，能分別在12-27h內(nèi)將10mmol/L的硝酸鹽完全去除。對(duì)兩株篩選細(xì)菌的生理生化鑒定、分子水平的鑒定分析以及系統(tǒng)發(fā)育分析表明：細(xì)菌HS-N25屬于Bacillus cereus(蠟狀芽孢桿菌)，細(xì)菌HS-N24屬于Pseudomonas putida(惡臭假單胞菌)。到目前為止，蠟狀芽孢桿菌關(guān)于其降解硝酸鹽、亞硝酸鹽的特性還未見報(bào)道。對(duì)四株細(xì)菌降解含氮廢水的研究，為高效、經(jīng)濟(jì)地處理含氮廢水提供了切實(shí)可行的技術(shù)資源和理

4、論基礎(chǔ)，并為生物快速脫氮凈化水處理提供了有用的菌源。四株細(xì)菌分別篩選于不同的自然環(huán)境，對(duì)四株細(xì)菌降解廢水能力的應(yīng)用研究，將有利于合理開發(fā)利用自然資源，保護(hù)自然生態(tài)環(huán)境。 固定化微生物技術(shù)作為一種新的廢水處理方法，已成為生物工程技術(shù)的一個(gè)重要分支。本文對(duì)反硝化菌的固定化工藝及去除廢水中NH4-N的效果進(jìn)行了探討。本文將篩選的HS-N25(Bacillus cereus)經(jīng)海藻酸鈉固定后，檢測(cè)其降解氨氮廢水的能力。經(jīng)過與未固定化的

5、細(xì)菌降解能力比較，結(jié)果表明，經(jīng)固定化后的微生物在低溫狀態(tài)(15℃)下降解廢水能力較強(qiáng)，同時(shí)還可有效降解含酚的有毒廢水。 一氧化二氮(N2O)的排放是導(dǎo)致目前全球氣候變暖和大氣平流層臭氧損耗的主要因素。一氧化二氮給生態(tài)環(huán)境和人們身體健康帶來嚴(yán)重危害，已引起各國(guó)科學(xué)家對(duì)它的重視。開展對(duì)一氧化二氮還原酶的研究，具有重要的實(shí)際意義。本文對(duì)反硝化細(xì)菌一氧化二氮還原酶的結(jié)構(gòu)基因nosZ進(jìn)行了克隆表達(dá)研究。以實(shí)驗(yàn)室保存種細(xì)菌P．stutze

6、ri HS-03基因組DNA為模板，根據(jù)Genbankqa的P.stutzer nosZ基因序列(NO．M2262)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1500bp的片段。將PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與克隆載體pMD18-T連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。經(jīng)BamHI和HindⅢ酶切鑒定證實(shí)構(gòu)建成功。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中表達(dá)。經(jīng)IPTG分別誘導(dǎo)后，重組質(zhì)粒pET28-nosZd在約為21 KD處有較大的表達(dá)量。將重組質(zhì)粒pMD-nosZ測(cè)序后得