新型基因組編輯蛋白FnCpf1的表達(dá)及其功能的初步探討.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建土拉弗朗西絲菌novicida亞種Cpf1蛋白編碼基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)、純化重組FnCpf1蛋白后，將純化蛋白免疫新西蘭大白兔制備兔抗FnCpf1多克隆抗體，間接ELISA法和Western blot分析制備抗體的免疫反應(yīng)性及特異性。并對(duì)FnCpf1功能做初步的探討。
　　方法：
　　1.以土拉弗朗西絲菌novicida亞種基因組為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增FnCpf1基因，將其克隆到

2、原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，并用雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證。
　　2.將構(gòu)建成功的pET-32a(+)-FnCpf1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，通過(guò)鎳離子金屬螯合磁珠親和純化FnCpf1蛋白。
　　3.將純化蛋白濃縮液與弗氏佐劑充分混合，免疫新西蘭大白兔制備FnCpf1多克隆抗體，并用間接ELISA法檢測(cè)兔抗血清效價(jià)、Western blot鑒定其特異性。
　　4.構(gòu)建一個(gè)插入失活

3、的mCherry熒光報(bào)告載體，將其轉(zhuǎn)化至表達(dá)FnCpf1蛋白的大腸桿菌感受態(tài)中，用肉眼直接觀察是否出現(xiàn)紅色菌落以判斷是否進(jìn)行了切割、重組。
　　結(jié)果：
　　1.擴(kuò)增得到3900bp目的基因片段，克隆到表達(dá)載體pET-32a(+)后，通過(guò)雙酶切鑒定大小與預(yù)期一致，測(cè)序結(jié)果與GenBank一致，證實(shí)pET-32a(+)-FnCpf1表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　2.可誘導(dǎo)表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量約為160kD的目的蛋白，經(jīng)SDS-PAG

4、E分析其為可溶性，通過(guò)鎳離子金屬螯合磁珠親和純化得到FnCpf1純化蛋白，Image Lab的體積工具分析結(jié)果表明純度為95％以上，BCA法測(cè)得超濾濃縮后的純化蛋白濃度為1.4mg/ml。
　　3.用純化蛋白免疫新西蘭大白兔3次后，制備多克隆抗體并檢測(cè)兔抗FnCpf1抗血清ELISA效價(jià)達(dá)1:512000，Western blot結(jié)果顯示制備的抗體可較好地與FnCpf1蛋白特異性結(jié)合。
　　4.將插入失活的mCherry熒光

5、報(bào)告載體轉(zhuǎn)化至表達(dá)FnCpf1蛋白的大腸桿菌感受態(tài)中，平板上可見(jiàn)紅色菌落長(zhǎng)出，而轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α的則未見(jiàn)紅色菌落。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了FnCpf1重組表達(dá)載體，并在原核系統(tǒng)中誘導(dǎo)、表達(dá)和純化FnCpf1重組蛋白。
　　2.用純化后的蛋白制備出兔抗FnCpf1抗體，效價(jià)及特異性均良好，為進(jìn)一步探討Cpf1蛋白的生物學(xué)特性打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　3.在表達(dá)FnCpf1的大腸桿菌中，利用CRISPR-Cp