Hs-MB型電化學(xué)活性開關(guān)分子信標(biāo)的研制及其應(yīng)用研究.pdf

1、伴隨著基因結(jié)構(gòu)和基因功能研究的深入開展，尤其是“人類基因組項目”完成后，對于人類相關(guān)疾病的基因診斷和基因治療的研究邁入了一個新的紀元，但其首要條件在于對致病基因堿基序列的識別和確定。而傳統(tǒng)的DNA測序方法存在一些局限，比如，勞動強度大且消耗時間較長。但是隨著Watson-Crick對堿基互補配對原則的深入探究，為分子生物學(xué)的相關(guān)研究和開發(fā)提供了一個全新的基因檢測方法-DNA探針。其中，以雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA探針技術(shù)，當(dāng)結(jié)合一些標(biāo)記方法

2、，比如，熒光法，電化學(xué)法，化學(xué)發(fā)光法后，將會使DNA探針得到一定程度的優(yōu)化使用，比如，免去了放射性物質(zhì)對人體的危害；降低了標(biāo)記物昂貴的價格；節(jié)省了操作時間等，具有特異性好，快速靈敏，操作簡便和無污染等特點，且還具有分離純化基因及分子識別的功能。目前這種類型的分子探針已經(jīng)成為基因研究領(lǐng)域中最具有吸引力的課題之一。
　　 最關(guān)鍵的問題在于怎樣找出導(dǎo)致各種各樣基因疾病的基因，并且具有高靈敏度和高選擇性。目前檢測DNA的錯配差異性最有用

3、的工具是分子信標(biāo)，其和線形信標(biāo)相比，具有高的目標(biāo)選擇性，因為信標(biāo)分子特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)使得在檢測前多了一步打開莖環(huán)結(jié)構(gòu)進而才與目標(biāo)物進行雜交反應(yīng)的過程。因此在某種程度上提高了選擇性。在本論文中，我們設(shè)計了一種新型的電化學(xué)分子信標(biāo)，將之命名為“新型電化學(xué)活性開關(guān)分子信標(biāo)”，其作用機理類似于傳統(tǒng)的以熒光基團一猝滅基團為基礎(chǔ)的分子信標(biāo)。在此，我們使用了具有二聚能力的卟啉鐵分子，并將其連接在分子信標(biāo)兩端，在沒有目標(biāo)分子存在時，連接在信標(biāo)兩端的完全相

4、同的卟啉鐵分子因為受到莖環(huán)的作用力而無限靠近，因此呈現(xiàn)二聚狀態(tài)，此時表現(xiàn)出非電化學(xué)活性特征，電化學(xué)信號被抑制；當(dāng)加入目標(biāo)分子時，分子信標(biāo)將于目標(biāo)序列互補結(jié)合，此時分子燈塔被迫使打開，連接在其上的兩個卟啉鐵分子也同時被強制分開，破壞了卟啉鐵的二聚體結(jié)構(gòu)而使卟啉鐵以單體狀態(tài)存在，因此此時電信號恢復(fù)。這種類型的信標(biāo)既具有傳統(tǒng)熒光信標(biāo)簡單快捷、易于控制的特點，又具有電化學(xué)技術(shù)成本低廉、易于小型化、便于野外操作的優(yōu)勢。本研究分為三個部分：

5、　　 第一章：緒論。以雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA探針技術(shù)，結(jié)合一些標(biāo)記方法后，比如，熒光方法，電化學(xué)方法，化學(xué)發(fā)光方法后，使DNA探針得到一定程度的優(yōu)化，為分子生物學(xué)的相關(guān)研究和開發(fā)提供了一個全新的基因檢測方法.分子信標(biāo)技術(shù)以其高選擇性及特異性成為目前基因研究領(lǐng)域中的熱點之一。本章通過對分子信標(biāo)技術(shù)，主要從熒光分子信標(biāo)和電化學(xué)分子信標(biāo)及卟啉鐵的性質(zhì)及應(yīng)用的歸納及總結(jié)，詳細說明了本論文所研究課題的理論基礎(chǔ)和選題依據(jù)。最后闡述了本論文的目的意

6、義及創(chuàng)新之處。
　　 第二章：Hemin電化學(xué)開關(guān)行為的探討和Hs-MB電化學(xué)活性開關(guān)分子信標(biāo)的合成研究。眾所周知，hemin是一種高度疏水性的分子，在中性和弱堿性溶液中具有較差的溶解性，大量的科研數(shù)據(jù)已經(jīng)證明：hemin溶液的物理和化學(xué)性質(zhì)隨著它的聚集狀態(tài)的改變而改變，因為hemin的結(jié)構(gòu)中存在疏水性基團乙烯基，致使hemin的卟啉結(jié)構(gòu)部分聚集趨勢相當(dāng)明顯。本章通過實驗證明hemin的單體和二聚體的電信號值存在很大的差異，可以

7、將其用在新型電化學(xué)活性分子開關(guān)上。同時，通過采用各種方法對所合成的新型電化學(xué)活性開關(guān)分子信標(biāo)進行表征。實驗結(jié)果表明，合成出的分子信標(biāo)良好，為新型信標(biāo)在生物化學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三章：基于Hs-MB型電化學(xué)活性開關(guān)分子信標(biāo)的應(yīng)用研究。p53基因是一種重要的致癌基因。據(jù)文獻報道，人類50％的腫瘤是因為存在p53基因的突變或缺失，因此p53基因的檢測就顯得至關(guān)重要。在本章中，我們首先合成了一種Hs-MB型電化學(xué)活性開關(guān)

8、分子信標(biāo)，這種類型的信標(biāo)分子在未加目標(biāo)分子的情況下沒有電化學(xué)信號，但當(dāng)與完全互補雜交序列發(fā)生雜交反應(yīng)后則產(chǎn)生電化學(xué)信號，并將其應(yīng)用于p53基因的定性、定量檢測及其SNP突變的識別。實驗結(jié)果證明，電化學(xué)檢測DPV的峰電流值與目標(biāo)DNA的濃度之間有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=8E-08x+2E-07(x為目標(biāo)序列的濃度，y為響應(yīng)的峰電流值，R=0.9861)，得到其最低檢測限為3nmol。且對一堿基錯配序列與完全互補序列的響應(yīng)信號有較明顯