免疫共沉淀與質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)TRIM3相互作用蛋白.pdf

1、鑒定已知蛋白的相互作用蛋白為探究其蛋白功能和分子機(jī)制提供重要依據(jù)。確定蛋白的相互作用的方法之一是免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）后進(jìn)行質(zhì)譜（mass spectrometry，MS），這種方法可以確保從生理?xiàng)l件下的細(xì)胞或組織中分離、鑒定靶蛋白和其相互作用蛋白。
　　本文主要先通過(guò)Co-IP與LC-MS聯(lián)用檢測(cè)TRIM3的相互作用蛋白，后對(duì)檢測(cè)的結(jié)果分析、篩選，再通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證質(zhì)譜

2、檢測(cè)結(jié)果，且在宮頸癌和乳腺癌細(xì)胞中探究TRIM3的功能，與質(zhì)譜結(jié)果對(duì)照。本課題研究的主要工作是：
　　（1）通過(guò)Co-IP、LC-MS/MS聯(lián)用檢測(cè)HeLa細(xì)胞中能與TRIM3相互作用的蛋白，對(duì)這些蛋白的定位、功能和作用進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，來(lái)更全面的探究在復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中，TRIM3是如何發(fā)揮其功能的。本文檢測(cè)到了227個(gè)能與TRIM3相互作用的蛋白質(zhì)，這些蛋白中有部分是p53信號(hào)通路的重要成員。
　　（2）通過(guò)質(zhì)譜篩選出p5

3、3信號(hào)通路后，進(jìn)行Western Blot、免疫印跡等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM3與重要抑癌蛋白p53間的作用，結(jié)果顯示TRIM3可以使p53蛋白水平下調(diào)。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)TRIM3對(duì)p53靶蛋白p21啟動(dòng)子活性的影響，結(jié)果顯示在缺失p53時(shí)TRIM3不能影響p21的轉(zhuǎn)錄，而p53存在時(shí)TRIM3通過(guò)下調(diào)p53來(lái)抑制p21的轉(zhuǎn)錄。
　?。?）探究TRIM3在宮頸癌細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系中的作用。實(shí)驗(yàn)方法如下：通過(guò)RT-PCR檢查T(mén)RI

4、M3在不同細(xì)胞系中mRNA水平的表達(dá)情況，結(jié)果顯示中T-47D中TRIM3表達(dá)較多，HeLa中TRIM3表達(dá)較少；通過(guò)MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM3對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示TRIM3可以顯著抑制宮頸癌細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系的增殖，而這不依賴(lài)于p53；通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM3對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響，TRIM3不能影響細(xì)胞的遷移；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TRIM3對(duì)細(xì)胞周期的影響，在有p53存在時(shí)TRIM3才能影響細(xì)胞周期進(jìn)程。