熒光相關(guān)光譜與微流控芯片聯(lián)用單分子檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、熒光相關(guān)光譜（Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS），是一種通過測(cè)定溶液中微區(qū)內(nèi)（通常<10－15L）發(fā)光粒子由于運(yùn)動(dòng)或化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的熒光漲落（熒光強(qiáng)度的明暗變化），并對(duì)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的函數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，從中獲得粒子濃度、擴(kuò)散系數(shù)、化學(xué)動(dòng)力學(xué)參數(shù)等有關(guān)信息的分析方法。FCS于1972年由Magde等人基于波動(dòng)光譜的概念提出。在其發(fā)展之初，由于計(jì)算機(jī)技術(shù)、光學(xué)技術(shù)以及光學(xué)檢測(cè)技術(shù)的限制

2、，人們一直無法減小照射體積、提高信噪比和靈敏度，技術(shù)發(fā)展緩慢。直到1993年，Rigler等人采用激光共焦技術(shù)使檢測(cè)體積降到10-15L以下，靈敏度得到顯著提高，自此FCS技術(shù)進(jìn)入了快速發(fā)展通道。 以微流控芯片為代表的微型全化學(xué)分析系統(tǒng)(miniaturized total analysis system，?-TAS)，是當(dāng)今分析領(lǐng)域的熱點(diǎn)。經(jīng)過十余年的發(fā)展，其集成度不斷提高，同時(shí)對(duì)芯片中反應(yīng)過程的表征手段提出了新的要求。熒光相

3、關(guān)光譜具有極高的靈敏度，對(duì)所分析的過程不產(chǎn)生機(jī)械干擾，能夠準(zhǔn)確地反應(yīng)微區(qū)內(nèi)熒光粒子的濃度、遷移速率及化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)，且具有雙光束交叉相關(guān)譜等多種結(jié)構(gòu)模式來適應(yīng)不同的研究需要。因此，熒光相關(guān)光譜勢(shì)必將成為表征微流控芯片內(nèi)部過程的有力方法，其二者的聯(lián)用技術(shù)顯示出廣闊的發(fā)展前景。 本論文基于激光共焦構(gòu)型，構(gòu)建了一套高靈敏度、高穩(wěn)定性的熒光相關(guān)光譜單分子檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用激光激發(fā)，用高數(shù)值孔徑物鏡使激光束聚焦，并用同一物鏡收集樣品

4、的熒光，單光子計(jì)數(shù)器用于實(shí)時(shí)記錄熒光信號(hào)，該熒光信號(hào)用相關(guān)器實(shí)時(shí)相關(guān)。整個(gè)系統(tǒng)保持物鏡焦點(diǎn)、針孔以及單光子計(jì)數(shù)器光敏區(qū)同軸。光學(xué)收集方面采取針孔與單光子計(jì)數(shù)器直接耦合，使光學(xué)收集效率得到更好的提高。在此FCS系統(tǒng)基礎(chǔ)上，建立了一套簡(jiǎn)單有效的FCS與微流控芯片聯(lián)用裝置。該裝置通過顯微鏡與攝像頭對(duì)芯片通道進(jìn)行放大成像，可以有效地輔助對(duì)焦工作。 本文發(fā)展了一套符合與FCS聯(lián)用要求的微流控芯片制作方法。該種微流控芯片采用聚二甲基硅氧烷（

5、PDMS）材料與蓋玻片雜交而成，經(jīng)試驗(yàn)證明，聯(lián)用系統(tǒng)中所得信號(hào)與開放體系中所得基本相同。本文同時(shí)對(duì)PDMS材料的選擇、蓋玻片的厚度校正及對(duì)焦方法等問題進(jìn)行了討論。 熒光相關(guān)光譜在多組分分析時(shí)不用通過分離手段，直接采用數(shù)學(xué)擬合方法即可獲得不同組分的擴(kuò)散系數(shù)。這是其優(yōu)點(diǎn)，但有時(shí)也限制了它的應(yīng)用，特別是當(dāng)組分間的分子量差異不很顯著時(shí)，常規(guī)熒光相關(guān)光譜就無法有效區(qū)分。為解決這個(gè)問題，van Orden等人首先將毛細(xì)管電泳技術(shù)與FCS聯(lián)用

6、，采用壓力驅(qū)動(dòng)，利用電場(chǎng)力使不同組分產(chǎn)生淌度差，對(duì)分子量差別較小的R6G和R6G-dUTP混合物進(jìn)行了組分比例分析，取得了良好的效果。但在試驗(yàn)中由于毛細(xì)管側(cè)壁為弧形，使入射激光產(chǎn)生折射，造成焦點(diǎn)形狀畸變，所得關(guān)聯(lián)函數(shù)用理論模型擬合效果較差，需要額外做條件實(shí)驗(yàn)并引入?yún)?shù)對(duì)理論模型進(jìn)行修正。本文利用微流控芯片代替毛細(xì)管與FCS聯(lián)用，由于芯片底部為厚度均勻的蓋玻片封裝，因此不會(huì)對(duì)激光造成不良影響。這種改變不僅可以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過程、提高準(zhǔn)確率，還可

7、以有效降低樣品需求量、減小電泳焦耳熱效應(yīng)。文中應(yīng)用自組裝FCS與微流控芯片聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)分子量相近混合物體系：不同比例的羅丹明綠琥珀酸脂與熒光素混合物（常規(guī)熒光相關(guān)譜無法區(qū)分）在單分子水平上進(jìn)行了分析，取得了令人滿意的分析結(jié)果。該方法有效地拓展了熒光相關(guān)光譜的應(yīng)用范圍，特別適合物質(zhì)相互作用研究。文中還對(duì)FCS數(shù)據(jù)處理方法中的一些問題進(jìn)行了討論。 FCS與微流控芯片聯(lián)用技術(shù)還可以進(jìn)一步應(yīng)用于分子相互作用研究、通道內(nèi)物質(zhì)遷移機(jī)理研究、與