β-葡萄糖苷酶Bgl2238的發(fā)酵優(yōu)化及對(duì)白藜蘆醇苷水解的初步研究.pdf

1、虎杖中的白藜蘆醇苷是一種β-糖苷，能被β-葡萄糖苷酶水解為白藜蘆醇。β-葡萄糖苷酶主要是來(lái)自于微生物中的真菌，比如木霉、曲霉等，酶活力低且溫度和pH等穩(wěn)定性范圍較窄，而且β-葡萄糖苷酶的售價(jià)高昂，限制了其在工業(yè)上的使用。由于自然界中的微生物有99％的是不可培養(yǎng)的，所以利用傳統(tǒng)方法發(fā)現(xiàn)酶活力高且酶學(xué)性質(zhì)良好的β-葡萄糖苷酶很困難。然而，宏基因組技術(shù)直接提取生境中的總DNA，不需要對(duì)微生物進(jìn)行分離和培養(yǎng)，使自然界中不能培養(yǎng)的微生物資源得到充

2、分的利用。
　　本課題對(duì)前期實(shí)驗(yàn)室從黑龍江玉米土壤中篩選并構(gòu)建的β-葡萄糖苷酶Bgl2238的重組大腸桿菌（E.coLi BL21（DE3）-pET32a-Bgl2238）采用響應(yīng)面（Box-Behnken）優(yōu)化的方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，最佳培養(yǎng)基配比為：甘油9.32g/L、酵母提取粉12g/L、胰蛋白胨19.13g/L、NaCl8g/L、K2HPO4·3H2O19.13g/L、KH2PO42g/L、檸檬酸高鐵按0.2g/L和微量元素母

3、液6mL/L。重組大腸桿菌Bgl2238最佳的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度37℃、起始pH8.0、3%接種量、25mL裝液量、IPTG終濃度為0.5mM。在250mL錐形瓶對(duì)重組子Bgl2238進(jìn)行發(fā)酵，在最優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件下，Bgl2238的酶活力可以達(dá)到2910U/L，比起始培養(yǎng)基中的酶活提高了61.77%。
　　文中對(duì)Bgl2238水解中藥材虎杖中白藜蘆醇苷的工藝進(jìn)行了初步的研究，得到了最佳酶解工藝為：加酶量1：4、料

4、液比1：25、酶解時(shí)間12h、溫度44℃、轉(zhuǎn)速120rpm，白藜蘆醇苷的水解率可以達(dá)到95%。用95%的乙醇對(duì)酶解后的虎杖粉溶液進(jìn)行了初步的提取，用HPLC檢測(cè)白藜蘆醇的含量為6.87%，比酶解前的含量提高了6倍。
　　為了進(jìn)一步降低工業(yè)中Bgl2238對(duì)虎杖水解的成本，本文采用先殼聚糖吸附，再戊二醛交聯(lián)的方法對(duì)Bgl2238進(jìn)行固定化，不僅可以使Bgl2238重復(fù)利用，而且穩(wěn)定性也得到了提高。通過(guò)單因素方法確定了Bgl2238固

5、定化的制備條件和固定化工藝：殼聚糖濃度為2.0%、乙酸的濃度為1.5%、NaOH的濃度為15%、甲醇的濃度為20%、戊二醛濃度為0.5%、最佳交聯(lián)時(shí)間為1h、最佳交聯(lián)溫度為20℃、最佳吸附時(shí)間為4h、Bgl2238粗酶液稀釋2倍。Bgl2238固定化酶的酶活回收率達(dá)到87%，酶活力為859.65mU/g。固定化Bgl2238的最適溫度為50℃，比游離的Bgl2238的最適溫度提高了6℃，且溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性都有所改善。為了考察固定化