SuhB調(diào)控銅綠假單胞菌運(yùn)動(dòng)與固著生存狀態(tài)轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　銅綠假單胞菌是臨床上一種重要的條件致病菌，其代謝能力極強(qiáng)，能夠通過(guò)多種信號(hào)通路感知環(huán)境信號(hào)，協(xié)調(diào)基因表達(dá)，進(jìn)行運(yùn)動(dòng)與固著生存狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換，以更好地適應(yīng)生活環(huán)境的變化。前期研究發(fā)現(xiàn)，suhB缺失后，泳動(dòng)能力減弱，然而生物被膜形成能力顯著提高，提示SuhB在細(xì)菌生存狀態(tài)的轉(zhuǎn)換中，可能起到了重要的調(diào)節(jié)作用。目前已知，在銅綠假單胞菌中，GacS/GacA雙組分系統(tǒng)和胞內(nèi)第二信使c-di-GMP信號(hào)途徑在急慢性感染轉(zhuǎn)換的調(diào)控網(wǎng)

2、絡(luò)中處于中心地位。此外，Gac/Rsm途徑與第二信使c-di-GMP也存在一定的關(guān)系。本研究以SuhB為切入點(diǎn)，研究SuhB調(diào)控銅綠假單胞菌生存狀態(tài)轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.分別用半固體培養(yǎng)基（含0.3％瓊脂）和結(jié)晶紫染色法檢測(cè)了野生型PAK、PAK△suhB和回補(bǔ)株的泳動(dòng)能力和24 h生物被膜生成量，以確定SuhB蛋白對(duì)銅綠假單胞菌表型的影響。
　　2.銅綠假單胞菌的泳動(dòng)由鞭毛介導(dǎo)，為了比較PAK△suh

3、B株與野生型PAK鞭毛合成相關(guān)基因fliC、fleQ和fleSR的轉(zhuǎn)錄差異，構(gòu)建了報(bào)告質(zhì)粒；同時(shí)構(gòu)建這些基因與Flag標(biāo)簽的融合蛋白，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)比較其蛋白表達(dá)差異。
　　3.為了探討SuhB對(duì)鞭毛結(jié)構(gòu)和功能的影響，我們利用透射電子顯微鏡檢測(cè)了suhB突變株的鞭毛結(jié)構(gòu)變化，并統(tǒng)計(jì)了其生有鞭毛的細(xì)胞的比例；同時(shí)，通過(guò)對(duì)鞭毛翻轉(zhuǎn)頻率的分析，檢測(cè)了其鞭毛功能變化。
　　4.前期研究發(fā)現(xiàn)，suhB突變株中g(shù)acA和小RNA分子rsm

4、Y/Z表達(dá)顯著上調(diào)。為了探究GacA-RsmY/Z途徑對(duì)SuhB介導(dǎo)的泳動(dòng)能力的影響，在suhB突變株中分別敲除gacA和rsmYrsmZ后檢測(cè)其泳動(dòng)能力變化；而rsmY/Z能夠拮抗RsmA的功能，因此在PAK△suhB株中過(guò)表達(dá)RsmA后，檢測(cè)了泳動(dòng)能力的變化。
　　5.由于cdrA表達(dá)與胞內(nèi)c-di-GMP水平相關(guān)，我們把cdrA的啟動(dòng)子克隆到pDN19lacZΩ載體，通過(guò)測(cè)定β-半乳糖苷酶活性，比較了野生型PAK、PAK△s

5、uhB和回補(bǔ)株胞內(nèi)第二信使c-di-GMP水平差異。
　　6.在野生型和suhB突變株中過(guò)表達(dá)能水解c-di-GMP的磷酸二酯酶PA2133，降低胞內(nèi)c-di-GMP水平后，檢測(cè)其泳動(dòng)能力和24 h生物被膜形成量的變化。
　　7.細(xì)菌生成的胞外多糖能夠結(jié)合平板中的剛果紅染料，隨著胞外多糖的增多菌落紅色逐漸加深，能夠較好地反映胞外多糖生成量。為了探究suhB突變株生物被膜生成能力顯著提高是否是由于胞外多糖生成增多，我們用剛果紅

6、實(shí)驗(yàn)比較了野生型PAK、PAK△suhB和回補(bǔ)株的胞外多糖合成量差異。
　　8.銅綠假單胞菌中，c-di-GMP的代謝有約40種酶參與。為了找出SuhB通過(guò)哪些酶影響其胞內(nèi)水平，我們利用熒光定量PCR比較了野生型和suhB突變株在OD600=1時(shí)，c-di-GMP代謝相關(guān)基因的表達(dá)差異。
　　9.結(jié)合熒光定量PCR結(jié)果，選擇性敲除了轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)的雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶編碼基因gcbA，并檢測(cè)了suhBgcbA雙突變株胞內(nèi)c-di

7、-GMP水平變化。同時(shí)檢測(cè)了其泳動(dòng)能力及生物被膜形成能力的變化，探討gcbA在SuhB調(diào)控通路中的作用。
　　結(jié)果：
　　1. PAK△suhB株的泳動(dòng)圈直徑顯著小于野生型菌株、生物被膜形成能力顯著高于野生型。用攜帶suhB基因的質(zhì)粒進(jìn)行遺傳互補(bǔ)后，兩種表型均回復(fù)到野生型水平。
　　2.報(bào)告質(zhì)粒分析顯示，野生型PAK和PAK△suhB菌株，fliC、fleQ和fleSR基因在轉(zhuǎn)錄水平基本沒(méi)有差異；蛋白印跡結(jié)果顯示，F(xiàn)l

8、eQ和 Flic兩種蛋白在PAK△suhB中表達(dá)并沒(méi)有降低。
　　3.透射電子顯微鏡觀(guān)察到野生型 PAK、PAK△suhB和回補(bǔ)株均生有結(jié)構(gòu)完整的單端鞭毛，并且生有鞭毛的細(xì)胞的比例也沒(méi)有顯著差異，野生型和PAK△suhB菌株長(zhǎng)有鞭毛的菌體分別占91.3%和88.5%；然而，對(duì)鞭毛的翻轉(zhuǎn)頻率分析顯示，suhB突變株的鞭毛翻轉(zhuǎn)頻率較野生型顯著降低，說(shuō)明SuhB在功能水平，通過(guò)影響鞭毛的翻轉(zhuǎn)頻率對(duì)細(xì)菌泳動(dòng)能力進(jìn)行調(diào)節(jié)。
　　4.敲

9、除gacA或過(guò)表達(dá)RsmA后，suhB突變株的泳動(dòng)能力能夠部分回復(fù)，說(shuō)明GacA-RsmY/Z-RsmA途徑參與了SuhB介導(dǎo)的對(duì)細(xì)菌泳動(dòng)能力的調(diào)控。
　　5. suhB突變株胞內(nèi)c-di-GMP的水平顯著高于野生型，而suhB回補(bǔ)菌株則回復(fù)到了野生型水平。
　　6. suhB突變株中過(guò)表達(dá)PA2133后，胞內(nèi)c-di-GMP水平顯著降低，泳動(dòng)能力部分回復(fù)。當(dāng)用激光共聚焦顯微鏡對(duì)生物被膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀(guān)察時(shí)，發(fā)現(xiàn)其生成量和厚度顯著

10、降低。
　　7.剛果紅實(shí)驗(yàn)顯示，回補(bǔ)株菌落顏色最深，表面有皺褶，為深紅色；野生型較回補(bǔ)株顏色淡，但較suhB突變株顏色深。
　　8.熒光定量PCR結(jié)果顯示，suhB突變株中PA4367、PA0861、PA5017、PA3311、PA1727及bdlA表達(dá)顯著下調(diào)，而具有雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶活性的PA4843(gcbA)表達(dá)顯著上調(diào)。
　　9.敲除gcbA后，suhB突變株胞內(nèi)c-di-GMP水平顯著降低，泳動(dòng)能力部分回復(fù)，生

11、物被膜形成能力降低。說(shuō)明 SuhB通過(guò)抑制 gcbA的表達(dá)，降低胞內(nèi)c-di-GMP水平，從而促進(jìn)細(xì)菌泳動(dòng)，同時(shí)抑制生物被膜的形成。
　　結(jié)論：
　　以上結(jié)果表明， c-di-GMP信號(hào)和GacA-RsmY/Z-RsmA途徑參與了SuhB介導(dǎo)的銅綠假單胞菌生存狀態(tài)調(diào)控。suhB缺失后，雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶 GcbA表達(dá)上調(diào)，c-di-GMP合成增加，導(dǎo)致泳動(dòng)能力降低；同時(shí)促進(jìn)細(xì)菌對(duì)物體表面的可逆性黏附轉(zhuǎn)換為不可逆性黏附，有利于生物