基于toehold鏈置換輔助目標(biāo)循環(huán)放大的新型熒光生物傳感器的研究.pdf

1、熒光生物傳感器是一種將特定分子識別事件與熒光轉(zhuǎn)換過程相結(jié)合的裝置。由于它們具有設(shè)備簡單、選擇性好和響應(yīng)快速等的優(yōu)點，自從首次構(gòu)建，便被期望在疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測和食品安全中發(fā)揮重要的分析作用。然而，在實際分析檢測中目標(biāo)物的濃度通常處于相對較低的水平，這就需要研究人員設(shè)計信號放大策略來提高傳感器的靈敏度?？紤]到酶輔助循環(huán)放大反應(yīng)容易受到溫度、酸堿度等環(huán)境因素的影響，因此本研究主要致力于開發(fā)簡單、方便的非酶信號放大方法用于檢測不同的目標(biāo)分子，

2、并獲得了一系列有效的結(jié)果。我們將所進行的研究工作的具體內(nèi)容總結(jié)如下：
　　1. MicroRNA激活的分子機器用于非酶目標(biāo)循環(huán)放大檢測癌細胞中的microRNA
　　失調(diào)表達的 microRNA可以作為不同癌癥早期診斷的有用的生物標(biāo)志物?；谛路f的目標(biāo)激活的非酶目標(biāo)循環(huán)放大DNA機器，本文提出了一種簡單高靈敏的熒光方法用于檢測前列腺癌細胞中的 microRNA。目標(biāo)物 miR-141與熒光猝滅的 DNA復(fù)合探針的末端區(qū)域進行

3、toehold鏈置換反應(yīng)(TSDR),導(dǎo)致了FAM標(biāo)記的信號探針從復(fù)合探針中釋放，并且產(chǎn)生了另一個 toehold區(qū)域用于隨后與燃料鏈雜交。一旦與該 toehold區(qū)域結(jié)合，燃料鏈便通過第二個toehold鏈置換反應(yīng)置換了雜交在復(fù)合探針上miR-141并且激活了該DNA機器，使得miR-141進行目標(biāo)物循環(huán)并導(dǎo)致大量的釋放信號探針用于放大檢測 miR-141，其檢測限達到80fM。該方法也展示了高的選擇性，同時可以用于監(jiān)測癌細胞中的 m

4、iR-141。此外，我們構(gòu)建的方法避免了使用蛋白酶進行目標(biāo)物循環(huán)放大，因此在未來的生物分析領(lǐng)域可以提供重要的應(yīng)用價值。
　　2.目標(biāo)響應(yīng)適配體機器用以免標(biāo)記的和靈敏的非酶循環(huán)放大檢測ATP
　　ATP的濃度異常與許多疾病相關(guān)，開發(fā)簡單和靈敏的方法用于鑒定和檢測ATP在臨床診斷中至關(guān)重要。在這項工作中，基于一種新穎的ATP響應(yīng)分子適配體機器，我們開發(fā)了一種非酶信號放大方法，這種方法可以敏感的檢測人類血清中的ATP。目標(biāo)ATP與

5、三鏈DNA復(fù)合探針中的 ATP適配體結(jié)合使得該適配體的構(gòu)型改變，并導(dǎo)致 toehold區(qū)域的暴露。燃料DNA隨后雜交到該區(qū)域上，通過toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)釋放了G-四鏈體活性序列和目標(biāo)ATP。這樣，ATP分子可以循環(huán)再利用使得釋放許多G-四鏈體活性序列，這些被釋放的活性序列與 N-甲基卟啉二丙酸 IX（NMM）結(jié)合產(chǎn)生顯著放大的熒光信號，用于靈敏的檢測低至25nM的 ATP。此外，這種方法對于其他對照分子也展示出高選擇性，并且可

6、以用于檢測稀釋的血清樣品中的 ATP。另外，我們的方法避免使用酶和納米材料進行信號放大，也未標(biāo)記信號讀出探針。因此，經(jīng)過精心的改進設(shè)計，這里提出的傳感平臺具有很大的潛力用于簡單的和敏感的檢測其他小分子。
　　3.金屬toehold激活催化發(fā)夾組裝形成的三向DNAzyme連接體用于放大熒光檢測汞離子
　　由于汞離子對環(huán)境和人體不可逆的毒性影響，開發(fā)一種可靠的并具有高選擇性和靈敏的汞離子檢測方法具有重要意義。借助于通過金屬 to

7、ehold觸發(fā)催化發(fā)夾組裝（catalytic hairpin assembly, CHA）形成的三向DNAzyme連接體的高效的信號放大能力，我們構(gòu)建了一種可用于測定不同水環(huán)境樣品中汞離子的高靈敏和高選擇性的方法。存在目標(biāo)汞離子可導(dǎo)致形成T-Hg2+-T堿基錯配金屬toehold結(jié)構(gòu)，這樣便觸發(fā)了含有分裂DNAzyme的三個發(fā)夾經(jīng)過催化組裝以形成依賴于鎂離子進行底物鏈剪切的 DNAzyme連接體。接著，鎂離子循環(huán)切割熒光猝滅的底物鏈結(jié)