基于自組裝和目標(biāo)物循環(huán)信號(hào)放大的新型電化學(xué)生物傳感器研究.pdf

1、近幾年來(lái)，快速、簡(jiǎn)單、靈敏的生物分子檢測(cè)在臨床診斷、食品分析、生物恐怖主義的防御和環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面變得日益重要。電化學(xué)生物傳感器由于具有簡(jiǎn)單、靈敏、成本低并可廣泛運(yùn)用于不同領(lǐng)域的固有優(yōu)勢(shì)而受到越來(lái)越多的關(guān)注。為了實(shí)現(xiàn)高靈敏的生物檢測(cè)，不同信號(hào)放大方法被用于傳感器的構(gòu)建中。因此，本論文從簡(jiǎn)化操作步驟出發(fā)，主要側(cè)重于自組裝（電極表面單分子層的組裝、納米材料的組裝及DNA自組裝技術(shù)）和目標(biāo)物(DNA、生物小分子)循環(huán)技術(shù)作為信號(hào)放大手段的研究，

2、創(chuàng)造性開發(fā)分析新平臺(tái)。并對(duì)其相應(yīng)原理及性能等進(jìn)行了全面地探索和研究。研究工作可分為以下幾個(gè)部分:
　　1.量子點(diǎn)層層自組裝信號(hào)放大標(biāo)記物構(gòu)建基于適體的高靈敏電致化學(xué)發(fā)光凝血酶?jìng)鞲衅?br>　　我們提出了一種新型電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)放大納米復(fù)合材料的制備方法及應(yīng)用實(shí)例。將生物素和鏈霉親和素分別修飾的碲化鎘量子點(diǎn)通過(guò)層層自組裝的方式自組裝到聚苯乙烯微球表面后與核酸適體交聯(lián)制各電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)放大探針。樣品中待測(cè)目標(biāo)物凝血酶與電極表面固定的

3、核酸適體探針和電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)放大探針發(fā)生生物分子識(shí)別后形成夾心式結(jié)構(gòu)。相對(duì)于傳統(tǒng)單個(gè)量子點(diǎn)標(biāo)記的凝血酶電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，該種方法在每一次適體/凝血酶結(jié)合事件中可引入為數(shù)眾多的發(fā)光體量子點(diǎn)而顯著增強(qiáng)電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的高靈敏檢測(cè)，其檢測(cè)限達(dá)到350 fmol L-1。該種新型信號(hào)放大檢測(cè)策略也能廣泛地運(yùn)用于其他重要生物分子（例如:蛋白質(zhì)，肽類，氨基酸，細(xì)胞等）的超低濃度檢測(cè)。因此，該種信號(hào)放大策略對(duì)于疾病的早期診斷具有較

4、大的應(yīng)用潛力。
　　2.基于發(fā)夾形DNA和石墨烯/納米金復(fù)合材料的目標(biāo)物循環(huán)放大高靈敏免標(biāo)記阻抗檢測(cè)DNA的研究
　　基于酶輔目標(biāo)物循環(huán)、石墨烯/納米金復(fù)合材料及發(fā)夾形DNA探針，我們構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單高靈敏的電化學(xué)交流阻抗法用于免標(biāo)記DNA檢測(cè)。目標(biāo)DNA與自組裝于石墨烯/納米金復(fù)合材料修飾印刷碳電極表面的發(fā)夾形DNA探針雜交。外切酶Ⅲ(ExoⅢ)可以選擇性剪切與目標(biāo)物雜交打開形成互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)的發(fā)夾形DNA探針，從而釋放出目標(biāo)

5、DNA。被釋放出的DNA再次與余下的捕獲探針雜交，在ExoⅢ存在下剪切DNA捕獲探針。結(jié)果，痕量的目標(biāo)物就可以移除電極表面上大量的發(fā)夾形DNA捕獲探針，使得阻抗信號(hào)明顯降低。由于高效的催化性目標(biāo)物循環(huán)信號(hào)放大作用，可以實(shí)現(xiàn)飛摩級(jí)水平的檢測(cè)。因此，這種傳感方法能推廣應(yīng)用于免標(biāo)記電化學(xué)阻抗法檢測(cè)痕量DNA的研究中。
　　3.基于原位雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)信號(hào)放大高靈敏電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)DNA的研究
　　運(yùn)用一種新的通過(guò)原位雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HC

6、R)信號(hào)放大的高靈敏電致化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)特異性DNA序列，檢測(cè)限達(dá)到飛摩級(jí)水平。將DNA捕獲探針自組裝于金電極表面構(gòu)建傳感界面。待測(cè)液中的目標(biāo)DNA與電極表面的探針DNA雜化之后，將其與兩條發(fā)夾結(jié)構(gòu)的輔助DNA孵育，通過(guò)HCR反應(yīng)在電極表面原位形成長(zhǎng)的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。這些DNA雙鏈體能結(jié)合大量的電致發(fā)光信號(hào)分子(Ru(phen)32+)從而放大分析信號(hào)。由于該方法結(jié)合HCR反應(yīng)信號(hào)放大和電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)本身的高靈敏性，因此可以實(shí)現(xiàn)飛

7、摩級(jí)的DNA檢測(cè)。同時(shí)，我們的檢測(cè)方法還對(duì)單堿基錯(cuò)配具有較高的選擇性。這些特性使得該方法成為高靈敏DNA檢測(cè)的有效技術(shù)之一。
　　4.一種基于酶輔助目標(biāo)物循環(huán)與超夾心組裝的新型集成信號(hào)放大策略用于超靈敏電化學(xué)DNA檢測(cè)
　　這里，我們提出了一種高靈敏檢測(cè)特異性DNA序列的電化學(xué)方法，該方法將N.BstNBⅠ(一種核酸內(nèi)切酶)-輔助的目標(biāo)物循環(huán)放大和DNA超夾心自組裝信號(hào)增強(qiáng)統(tǒng)一于一體。目標(biāo)DNA與固定在磁珠表面的發(fā)夾形探針雜

8、交形成部分雙鏈結(jié)構(gòu)和N.BstNBⅠ特異性酶切位點(diǎn)。N.BstNBⅠ酶選擇性剪切雜交的DNA探針并釋放出目標(biāo)DNA，被釋放的目標(biāo)序列再與其他發(fā)夾形探針雜交從而引發(fā)目標(biāo)物循環(huán)，并產(chǎn)生大量被剪切的中間體DNA片段。然后，大量的中間體DNA片段在電極表面充當(dāng)了組裝輔助探針形成DNA超夾心結(jié)構(gòu)的橋梁。形成的DNA超夾心在電極表面靜電結(jié)合大量氧化還原探針(Ru(NH3)63+)，顯著放大用于DNA定量的分析信號(hào)。因此，將酶輔助目標(biāo)物循環(huán)與超夾心組

9、裝集成于一體，為低至飛摩水平(0.36 fmol L-1)的超靈敏電化學(xué)DNA檢測(cè)提供了一種有效的信號(hào)放大途徑。此外，我們提出的傳感策略不僅具有高靈敏性和優(yōu)良的選擇性，還便于操作，因?yàn)楸苊饬祟~外的化學(xué)標(biāo)記步驟并利用了磁珠便于分離富集的優(yōu)點(diǎn)，這有利于DNA檢測(cè)過(guò)程，使得該方法具有較大的運(yùn)用于基因相關(guān)疾病早期診斷的潛在可能性。
　　5.目標(biāo)物誘導(dǎo)適體/DNA酶超夾心納米結(jié)構(gòu)自動(dòng)解組裝電致發(fā)光信號(hào)增強(qiáng)的靈敏性O(shè)TA檢測(cè)
　　自組裝

10、DNA納米結(jié)構(gòu)是納米科學(xué)里最熱門的研究領(lǐng)域之一，然而，其運(yùn)用于生物傳感器的研究還處于萌芽階段?；谀繕?biāo)物誘導(dǎo)對(duì)適體/DNA酶超夾心納米結(jié)構(gòu)的自動(dòng)解組裝作用，我們提出了一種高靈敏電致化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)赫曲霉毒素A(OTA)的策略。自組裝到金電極表面的適體/DNA酶超夾心納米結(jié)構(gòu)對(duì)O2/S2O82-體系的ECL具有顯著的淬滅作用。目標(biāo)物OTA和核酸外切酶RecJf的出現(xiàn)使該納米結(jié)構(gòu)自動(dòng)解組裝及OTA重復(fù)利用，導(dǎo)致被淬滅的ECL得以有效恢