環(huán)介導等溫擴增快速檢測病原菌新型試劑盒研制項目實施方案報告

1、 一、選題的必要性1、項目所處技術(shù)領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)政策本項目屬生物高技術(shù)領(lǐng)域，是國家重點支持的研究領(lǐng)域，項目主要針對嚴重影響人類健康的主要病原菌的檢測與診斷需要進行檢測技術(shù)的研究與試劑盒的開發(fā)，本項目的實施可產(chǎn)生具有自主知識產(chǎn)權(quán)的科研成果。本項目技術(shù)含量高，市場競爭力強，項目完成后能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟效益和社會效益，項目符合國家產(chǎn)業(yè)、技術(shù)政策。2、項目所處技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀目前的病原菌檢測方法費時、費力、

2、準確性低，開發(fā)快速、準確、低成本的檢測技術(shù)和配套試劑是病原菌檢測工作中亟待攻克的難題。本項目針對病原菌檢測中存在的問題，采用高靈敏度、高特異性的環(huán)介導等溫擴增技術(shù)開發(fā)出簡便、快速、經(jīng)濟的檢測試劑。3、項目技術(shù)先進性，對相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)進步的推動作用環(huán)介導等溫擴增是利用 4 個特殊設(shè)計的引物和具有鏈置換活性的DNA 聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地擴增 DNA 的新技術(shù)。該技術(shù)在 1h 內(nèi)能擴增出 109 靶序列拷貝。LAMP 技術(shù)以其

3、特異性強、設(shè)計了部分引物，現(xiàn)正通過實驗確定這些引物的性能。（2）本項目的另一技術(shù)關(guān)鍵是最佳等溫擴增體系優(yōu)化。通過對引物濃度、內(nèi)引物和外引物的最佳濃度比、模板濃度、dNTP 濃度、BstDNA 聚合酶用量、Mg2+濃度等條件進行優(yōu)化，能夠獲得最佳實驗條件。2、創(chuàng)新點（1）既往對病原菌的檢測一般采用細菌分離培養(yǎng)鑒定法，但該方法的準確率低，所需時間長，往往延誤臨床正確的診斷和治療。近年來，人們將 PCR 技術(shù)用于病原菌的檢測。PCR 技術(shù)雖然

4、較傳統(tǒng)方法靈敏、快速，但需要較昂貴的儀器設(shè)備。更為重要的是，PCR 方法容易產(chǎn)生非特異性擴增產(chǎn)物，造成假陽性和假陰性結(jié)果，影響對樣品的正確判斷。本項目將建立適合于食品和臨床標本大規(guī)模檢測的環(huán)介導等溫擴增快速檢測病原菌技術(shù)。與目前的檢測方法相比，等溫擴增法具有快速、準確、靈敏的特點。而且，等溫擴增法是在恒溫下進行，只需一個簡單的恒溫裝置，不需要 PCR 實驗中的昂貴儀器，因而易于在基層食品質(zhì)量檢測部門和醫(yī)院推廣使用。（2）目前，國外已有將