新型凝集載體的研制及其在食品安全快速檢測中的初步應(yīng)用.pdf

1、食品安全歷來是人們關(guān)注的的焦點(diǎn)問題，而食源性致病菌引起的公共衛(wèi)生安全問題是食品安全最大的隱患之一。對食源性致病菌的檢測技術(shù)主要分為傳統(tǒng)檢測技術(shù)和現(xiàn)代快速檢測技術(shù)，現(xiàn)代快速檢測技術(shù)因具有快速、簡便、成本低、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。間接凝集試驗(yàn)作為現(xiàn)代快速檢測技術(shù)的一種，能夠快速簡便的實(shí)現(xiàn)對致病菌的快速檢測，因而被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌學(xué)診斷。具有操作簡便、凝集現(xiàn)象直觀、致敏顆粒易保存、快速、無須借助高端儀器輔助檢測，檢測條件要求低等優(yōu)點(diǎn)而深受各

2、種檢測機(jī)構(gòu)的親睞。載體是間接凝集試驗(yàn)所必需的，也是凝集效果的關(guān)鍵影響因素。目前用于間接凝集試驗(yàn)的主要有動(dòng)物或人的紅細(xì)胞制備而成的紅細(xì)胞載體顆粒、活性炭粒載體、聚苯乙烯膠乳顆粒載體和明膠顆粒載體等。紅細(xì)胞作為載體顆粒，其大小均一，主要有綿羊、雞及家兔的紅細(xì)胞或O型人紅細(xì)胞。吸附的抗原類型主要是多糖類抗原，而蛋白質(zhì)抗原或抗體的吸附能力相對較差。紅細(xì)胞致敏后出現(xiàn)易溶血、變脆、污染等問題，對使用時(shí)間要求嚴(yán)格，通常必須在2-3天內(nèi)使用，紅細(xì)胞的穩(wěn)

3、定性較差，保存時(shí)間短。聚苯乙烯膠乳是一種人工合成的載體，粒徑約為0.8um的球形顆粒，均一性好，表面帶有負(fù)電荷，主要通過物理吸附的方式結(jié)合蛋白質(zhì)，但這種吸附結(jié)合方式牢固性較差，抗體或抗原易于從聚苯乙烯膠乳上脫落，自身的物理化學(xué)性質(zhì)也較為脆弱，容易受到各種理化因素的影響而出現(xiàn)自凝現(xiàn)象，最終導(dǎo)致凝集結(jié)果的誤判。而且這兩種常用的載體顏色單一，凝集顯現(xiàn)出來的凝集塊顏色也單一，依賴于自身所具有的顏色限制，在凝集過程中不能最大程度的放大反應(yīng)信號，因

4、此，選擇一種性能優(yōu)異，穩(wěn)定性好，易于染料修飾、能夠滿足各種需求的載體就顯得尤為重要。二氧化硅微球(Silica Microspheres，SMSs)因其尺寸易于控制，穩(wěn)定性強(qiáng)，生物相容性好，不易發(fā)生溶脹及保存期長等獨(dú)特優(yōu)勢而引起科研工作者的極大重視。二氧化硅微球本身無色，用于間接凝集試驗(yàn)并不能有效的放大反應(yīng)信號。為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，對微球表面進(jìn)行修飾，由于二氧化硅微球表面含有大量羥基或不飽和殘鍵，易于功能化，使得存在進(jìn)行表面染料修飾的可能

5、，這樣。獲得的微球在不影響自身性質(zhì)的同時(shí)又具有鮮艷的色澤，能夠最大程度的放大凝集信號，使凝集現(xiàn)象更加明顯、直觀。有機(jī)活性染料，分子中含有化學(xué)性活潑的基團(tuán)，在水溶液中可以通過共價(jià)結(jié)合的方式與棉、毛等纖維等反應(yīng)形成共價(jià)復(fù)合物?；钚匀玖戏肿釉诮Y(jié)構(gòu)上可以分為染料母體和活性基團(tuán)兩個(gè)主要部分，活性染料的發(fā)色結(jié)構(gòu)是染料母體，賦予染料不同色澤?；钚曰鶊F(tuán)是染料分子與纖維直接其反應(yīng)的基團(tuán)，不同活性基團(tuán)可以以不同方式與羥基進(jìn)行反應(yīng)。因此，從化學(xué)的角度來看，活

6、性染料如此多的種類和良好的化學(xué)反應(yīng)活性使得它非常適合對二氧化硅微球進(jìn)行染色。因此，將有機(jī)活性染料以穩(wěn)定的共價(jià)鍵修飾到微球表面，使微球著上鮮艷明亮的色澤，將能更有助于反應(yīng)信號的放大和獲得更加明顯的反應(yīng)現(xiàn)象。
　　綜上所示，本研究將嘗試通過反相微乳法合成納米級SiNps和半連續(xù)Stober法合成微米級SMSs，通過化學(xué)修飾的方式對微球表面進(jìn)行染料修飾，以硅烷偶聯(lián)劑為媒介通過共價(jià)鍵結(jié)合到微球表面，制備得Colored-SiNps和Col

7、ored-SMSs。再將制備得的彩色微球通過生物偶聯(lián)技術(shù)修飾上抗體，使具備免疫活性。并以彩色二氧化硅微球?yàn)檩d體構(gòu)建新型凝集技術(shù)用于食品中致病微生物的快速檢測，活性染料賦予了微球鮮艷的色彩，放大了凝集信號，使凝集現(xiàn)象更加醒目、直觀。本論文將主要從以下幾個(gè)方面探究了該新型凝集技術(shù)對致病菌和病毒的凝集性能，并優(yōu)化了凝集條件。
　　1基于Colored-SiNps微載體的新型凝集技術(shù)的凝集性能探究
　　為探究一種性能優(yōu)良的間接凝集試

8、驗(yàn)載體，本研究將嘗試通過反相微乳法合成SiNPs，對SiNps表面進(jìn)行活性大紅3G染料修飾，并優(yōu)化了染料的偶聯(lián)條件，制備得Red-SiNps，SEM表征Red-SiNps的形貌和粒徑。Nano2S激光粒度電位儀表征抗體修飾前后Red-SiNps的粒徑和電位變化，最后以此建立基于IgG-red-SiNps為載體的新型凝集技術(shù)，分別修飾上三種不同抗體與對應(yīng)菌或病毒分別在U型反應(yīng)板、V型反應(yīng)板和凹圓載玻片凝集，用數(shù)碼相機(jī)對凝集結(jié)果進(jìn)行表征。結(jié)

9、果表明:Red-SiNps粒徑均一規(guī)則，粒徑分布范圍窄，性能穩(wěn)定，單分散性好，顆粒顏色豐富，色澤選擇范圍廣。該研究不僅說明基于Colored-SiNps為載體的新型凝集技術(shù)在U型反應(yīng)板、V型反應(yīng)板和凹圓載玻片上的凝集性能優(yōu)異，特異性強(qiáng)，快速，準(zhǔn)確度高。而且也說明了基于IgG-red-SiNps為載體的新型凝集技術(shù)在這些反應(yīng)器中既對細(xì)菌如雞白痢雞傷寒沙門氏菌和阪崎腸桿菌的凝集性能優(yōu)異，對病毒如EDSV也有非常好的凝集性能。
　　2基

10、于Colored-SiNps微載體同時(shí)快速檢測兩種致病菌的新型凝集技術(shù)
　　基于Colored-SiNps為載體的新型凝集技術(shù)對于單種菌的凝集已經(jīng)顯示出了優(yōu)異的凝集性能和巨大優(yōu)勢，那么利用染料和SiO2易修飾的優(yōu)點(diǎn)探究該新型凝集技術(shù)對兩種致病菌的同時(shí)凝集就顯得尤為必要，因此，本研究旨在以阪崎腸桿菌和雞白痢雞傷寒沙門氏菌為凝集對象，探究一種同時(shí)與阪崎腸桿菌和雞白痢雞傷寒沙門氏菌混合液發(fā)生凝集反應(yīng)且呈現(xiàn)出兩種不同顏色凝集現(xiàn)象的新型凝集

11、技術(shù)。結(jié)果表明:基于IgG-red-SiNps和IgG-blue-SiNps為載體的新型凝集技術(shù)在對不同濃度雞白痢雞傷寒沙門氏菌和等量生理鹽水的混合溶液凝集過程中，IgG-blue-SiNps只與對應(yīng)的雞白痢雞傷寒沙門菌發(fā)生特異性凝集，出現(xiàn)了藍(lán)色凝集塊，且凝集現(xiàn)象隨著雞白痢雞傷寒沙門氏菌濃度的降低而有所減弱。修飾有板崎腸桿菌抗體的IgG-red-SiNps因沒有對應(yīng)菌與之凝集而均勻分散在液滴中，無紅色凝集塊出現(xiàn)。在與不同濃度阪崎腸桿菌和

12、生理鹽水的混合液凝集中，也出現(xiàn)上述相同結(jié)果。而該新型凝集技術(shù)在與一種菌濃度固定另一種菌濃度變化的混合菌液混合后凝集，會(huì)同時(shí)出現(xiàn)兩種分別為紅色和藍(lán)色的凝集塊，其中，菌液濃度固定的凝集塊大小不變，而濃度變化的菌液的凝集現(xiàn)象則隨著濃度的稀釋而逐漸減弱。在兩種菌的同時(shí)凝集過程中，凝集時(shí)間僅需20-30s，準(zhǔn)確性好，特異性好，可靠性強(qiáng)，過程簡便，凝集結(jié)果明顯、肉眼可觀，并且無交叉反應(yīng)。因此，基于SiNps為載體對兩種致病菌的同時(shí)凝集技術(shù)具有靈敏、

13、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定、簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
　　3基于Yellow-SiNps微載體快速檢測EDSV的新型凝集技術(shù)
　　本論文中已實(shí)現(xiàn)對單種致病菌和兩種致病菌的同時(shí)凝集，為了拓展基于SiNps載體新型凝集技術(shù)在病毒領(lǐng)域的檢測應(yīng)用，擬探究一種新型凝集技術(shù)檢測雞減蛋綜合征病毒(Egg drop syndromeviruses，EDSV)。本研究以Yellow-SiNps為間接凝集試驗(yàn)的載體，表面修飾EDS-76病毒的抗體，構(gòu)建了一種基

14、于免疫活性二氧化硅納米顆粒(Immuneyellow silica nanoparticles，IgG-yellow-SiNps)微載體的快速檢測EDSV的新型凝集技術(shù)。結(jié)果表明，該新型凝集技術(shù)過程簡便，凝集現(xiàn)象明顯、肉眼可觀，特異性好，無交叉反應(yīng)。對目標(biāo)菌溶液的檢測限是103～109cfu·mL-1，載體Yellow-SiNps對凝集結(jié)果無干擾、并能放大凝集反應(yīng)信號，說明基于yellow-SiNps為載體的新型凝集技術(shù)在檢測病毒方面也

15、具有靈敏、穩(wěn)定、簡便、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、等優(yōu)點(diǎn)，適用于病毒的凝集檢測，并且凝集性能優(yōu)異。
　　4單分散微米級二氧化硅微球的制備研究
　　通過對納米級二氧化硅微粒新型凝集技術(shù)的研究表明基于納米級二氧化硅微粒為載體構(gòu)建的新型凝集技術(shù)在檢測單種菌和病毒或同時(shí)檢測兩種菌都具有良好的凝集性能，在此基礎(chǔ)上，擬通過增大SiO2微粒的粒徑再次實(shí)現(xiàn)凝集信號的放大，并探究微米級SiO2微球(Micrometer-Sized Silica Mic

16、rospheres)對食源性致病菌的凝集性能。因此，本試驗(yàn)通過半連續(xù)Stober法制備微米級SiO2微球(Silicamicrospheres，SMSs)，并用活性大紅3G對微球表明進(jìn)行了修飾，探究了微米級SMSs的合成和染色機(jī)理。結(jié)果表明:通過半連續(xù)Stober法合成的微米級SMSs粒徑均一、形狀規(guī)則，具有鮮艷的色澤，粒徑分布范圍窄。
　　5基于Red-SMSs微載體快速檢測阪崎腸桿菌的新型凝集技術(shù)
　　通過半連續(xù)Stob

17、er法合成了微米級SMSs，擬以此建立一種基于微米級二氧化硅微球?yàn)檩d體快速檢測食源性致病菌的新型間接凝集技術(shù)，探究該新型凝集技術(shù)對阪崎腸桿菌的凝集性能。結(jié)果表明:基于Red-SMSs為載體的新型凝集技術(shù)，特異性好，無交叉反應(yīng);Red-SMSs的色澤鮮艷，使其凝集結(jié)果更加醒目，易于判斷;在4℃條件下能保藏近30天，穩(wěn)定性強(qiáng)，生物相容性好;對目標(biāo)菌的檢測限為103cfu·mL-1-109 cfu·mL-1?；谖⒚准壎趸铻檩d體構(gòu)建的新型