2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、人磷酸二酯酶同工酶4(phosphodiesterase,PDE4)選擇性水解cAMP,并分為PDE4A、4B、4C、4D四種亞型。參與炎癥反應(yīng)的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞以表達(dá)PDE4B2為主。因此,相應(yīng)的PDE4抑制劑可用于治療哮喘、慢性阻塞性肺病等炎癥相關(guān)疾病。磁珠固定化靶蛋白可快速篩選潛在抑制劑混合物,但需要低成本大量表達(dá)高活性靶蛋白。前期研究發(fā)現(xiàn),PDE4B2在原核細(xì)胞可溶表達(dá)豐度低且純化過程不穩(wěn)定。有報(bào)道顯示,現(xiàn)有PDE4B2抑制

2、劑的毒副作用與人全長(zhǎng)PDE4B2以咯利普蘭(R-rolipram)表征的高親和力結(jié)合構(gòu)象相關(guān),而治療作用與以R-rolipram表征的活性位點(diǎn)低親和力結(jié)合構(gòu)象相關(guān)。因此,本論文通過不同融合表達(dá)方式對(duì)PDE4B2全長(zhǎng)及152-528aa截短突變體進(jìn)行克隆表達(dá)純化及表征,以期獲得大量可溶表達(dá)的高表觀比活且處于以R-rolipram表征的低親和力結(jié)合狀態(tài)的PDE4B2融合蛋白。
  將人磷酸二酯酶4B2(hPDE4B2)全長(zhǎng)和152-5

3、28aa截短突變體融合6His-SUMO在大腸桿菌重組表達(dá),經(jīng)Ni2+-NTA純化獲得hPDE4B2全長(zhǎng)SF-hPDE4B2和截短突變體ST-hPDE4B2重組蛋白。用Western blot檢測(cè)多肽成分;用偶聯(lián)堿性磷酸酶的孔雀綠定磷法測(cè)定酶活性,表征其Km和對(duì)模型化合物的抑制常數(shù)。結(jié)果顯示,純化后的ST-hPDE4B2純度較SF-hPDE4B2高,ST-hPDE4B2(0.03 U·mg-1)表觀比活性接近SF-hPDE4B2(1.3

4、1 U·mg-1)的40倍,活性收率超過100倍;此表達(dá)純化方案總活性收率不高,且Westernblot顯示均有較多降解片段;測(cè)定(R)-Rolipram和罌粟堿的抑制常數(shù)表明,SF-hPDE4B2對(duì)(R)-Rolipram主要為高親和力結(jié)合構(gòu)象,而ST-hPDE4B2主要為低親和力結(jié)合構(gòu)象。對(duì)代表化合物的抑制常數(shù)進(jìn)行數(shù)學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)其雙對(duì)數(shù)模型具有單調(diào)相關(guān)性。因此,與SF-hPDE4B2相比,ST-hPDE4B2用于初步篩選抗炎活性hP

5、DE4B2抑制劑可能更有優(yōu)勢(shì)。
  用同源重組的方法將hPDE4B2全長(zhǎng)和152-528aa截短突變體基因克隆到帶有GST標(biāo)簽的載體pGEX-6P-1上,表達(dá)后經(jīng)GST親和層析柱純化分別獲得N-端融合GST的人全長(zhǎng)hPDE4B2(GF-hPDE4B2)和截短突變體(GT-hPDE4B2)。然而,純化后的GF-hPDE4B2最大表觀比活為0.01 U·mg-1,GF-hPDE4B2最大表觀比活為0.05 U·mg-1。GF-hPDE

6、4B2和GT-hPDE4B2酶活性收率均較低。
  進(jìn)一步探索雙標(biāo)簽純化方法,將hPDE4B2的N-端和C端與MBP和6-His標(biāo)簽三種形式融合:N-MBP/6His-C、N-6His/MBP-C和N-6His-MBP/6His-C,分別獲得 MCF-hPDE4B2/MCT-hPDE4B2(帶N-MBP/6His-C)、MNF-hPDE4B2/MNT-hPDE4B2(帶N-6His/MBP-C)、MF-hPDE4B2/MT-hPD

7、E4B2(帶 N-6His-MBP/6His-C)六種融合蛋白基因質(zhì)粒,表達(dá)后經(jīng)Ni2+-NTA和MBP親和層析純化獲得的全長(zhǎng)hPDE4B2表觀比活性依次是:MCF-hPDE4B2(1.11 U·mg-1)>MF-hPDE4B2(0.1 U·mg-1)>MNF-hPDE4B2(0.01 U·mg-1);截短突變體表觀比活性依次是:MCT-hPDE4B2(1.25 U·mg-1)>MNF-hPDE4B2(0.6 U·mg-1)>MF-hP

8、DE4B2(0.3 U·mg-1);全長(zhǎng)hPDE4B2和截短突變體重組蛋白的活性收率也顯著高于前兩種方案。鑒于測(cè)定 PDE4活性篩選抑制劑對(duì)靶蛋白活性的要求,以MCF-hPDE4B2和MCT-hPDE4B2為靶蛋白在成本上顯得更有優(yōu)勢(shì)。
  綜上所述,本研究成功獲得hPDE4B2全長(zhǎng)和截短突變體與三種不同標(biāo)簽的融合表達(dá)重組蛋白:融合6His-SUMO標(biāo)簽的hPDE4B2截短突變體的活性收率效果較hPDE4B2全長(zhǎng)好;融合GST標(biāo)簽

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