黑蕓豆凝集素的純化和生物信息學及結構與功能特性研究.pdf

1、凝集素是一類具有重要生物活性的糖蛋白，可用于血型鑒定、細胞信號傳導、惡性腫瘤細胞抑制、免疫應答和藥物靶向定位的研究中，同時，凝集素也是食品中的抗營養(yǎng)因子。凝聚素主要存在于豆類中，黑蕓豆是種植量較大的蕓豆品種之一，研究發(fā)現(xiàn)黑蕓豆中凝聚素的含量較高，但對黑蕓豆凝集素的結構及生物學性質(zhì)的認識非常有限。本文對黑蕓豆凝集素的分離純化、凝集素的結構、凝集素的理化性質(zhì)及生物學特性與凝集素結構之間的關系進行了系統(tǒng)性研究，可為豆類凝集素功能性開發(fā)提供理論

2、基礎。
　　本研究采用反膠束萃取方法對蕓豆水溶性蛋白粗提取物中的凝集素進行了分離純化，并研究了反膠束萃取方法對凝集素活性和結構的影響。確定反膠束萃取凝集素的工藝參數(shù)為：前萃取水相NaCl濃度為77.6 mmol/L，pH值為5.7，AOT（二(2-乙基已基)丁二酸酯磺酸鈉）濃度為127.4 mmol/L；后萃取水相KCl濃度為593.0 mmol/L，pH值為8.0；在最佳工藝條件下，凝集素的得率為63.2±2.4 mg蛋白/g豆

3、，純化倍數(shù)為8.8±0.2倍。反膠束萃取法對凝集素的活性沒有影響；經(jīng)傅立葉變換紅外光譜和圓二色光譜分析可知，反膠束萃取對凝集素蛋白二級結構沒有顯著的影響。反膠束法萃取的凝集素樣品經(jīng)色譜純化后純度可達到94％以上，比傳統(tǒng)的離子交換和分子篩純化方法的蛋白得率提高了70%。
　　基于LC-MS/MS方法，確定反膠束萃取分離純化的蛋白為凝集素，與PHA-E蛋白具有高度同源性。以黑蕓豆基因組DNA為模板，依據(jù)PHA-E蛋白cDNA序列合成的

4、特異引物進行同源克隆，獲得黑蕓豆凝集素蛋白的編碼基因序列。根據(jù)同源分析和進化分析可知，黑蕓豆凝集素高度保守，可能與PHA-E蛋白共同分化自Arc7變種。根據(jù)對黑蕓豆凝集素的生物信息學分析，黑蕓豆凝集素為親水蛋白，具有較高的穩(wěn)定性，含有疏水內(nèi)核區(qū)；在生理 pH值下黑蕓豆凝集素可能以四聚體形式存在，含有高度保守的Lectin_legB功能結構域；蛋白分子中含有Ca2+和Mn2+結合位點及可能與 N端糖基特異性結合的位點；研究表明黑蕓豆凝集素

5、含有B淋巴細胞抗原表位和T淋巴細胞抗原表位，具有潛在的抗癌細胞活性。
　　黑蕓豆凝集素單體分子量為31 kDa，四聚體分子量約為116.97 kDa；黑蕓豆凝集素單體的等電點在5.27左右，二聚體等電點在6.03左右，四聚體等電點在6.91左右。利用熒光光譜法證明黑蕓豆凝集素蛋白可與N-乙酰-D-葡萄糖胺發(fā)生特異性結合，親和常數(shù)約為0.45 mmol/L，為中等強度的親和作用?；谀鼗钚曰謴偷姆椒?，證明黑豆凝集素為金屬離子依賴

6、性蛋白，Mn2+和Ca2+是黑蕓豆凝集素蛋白的必需金屬離子。對黑蕓豆凝集素熱失活與蛋白構象之間的關系進行研究，發(fā)現(xiàn)加熱導致凝集素蛋白折疊結構的打開，使凝集素發(fā)生變性，凝集素的熱變性程度與加熱溫度和時間呈函數(shù)關系，其熱穩(wěn)定性符合一級動力學模型。采用紫外、熒光光譜和DSC法對黑蕓豆凝集素的酸堿穩(wěn)定性進行研究，結果表明在pH2.0～10.0范圍內(nèi)凝集素具有相對穩(wěn)定的蛋白構象。
　　采用指數(shù)數(shù)學模型分析電泳條帶光密度變化，建立了較為準確的

7、體外模擬胃腸道消化評價體系，研究結果表明：黑蕓豆凝集素在模擬胃液和胰蛋白酶消化環(huán)境下穩(wěn)定性較好，半衰期分別為23 min和大于90 min；加熱和去離子化處理改變了凝集素的蛋白構象，使得凝集素在模擬胃腸道環(huán)境下的消化性提高。MTT實驗研究證明，在2 h內(nèi)黑蕓豆凝集素對腸道模擬上皮細胞無明顯毒性作用。致敏實驗證明低劑量黑蕓豆凝集素（6 mg/120 g大鼠）未誘發(fā)動物模型的致敏癥狀，黑蕓豆凝集素可同時促進IL-4和INF-γ細胞因子的分泌

8、，兩者的拮抗作用可能導致IgE抗體的表達未達到陽性癥狀水平，研究結果證明低劑量黑蕓豆凝集素蛋白不具有致敏性。
　　初步研究了黑蕓豆凝集素對人宮頸癌Hela細胞的抑制作用，黑蕓豆凝集素的IC50值為9.85μg/mL，凝集素對Hela細胞的抑制能力與作用劑量和時間呈正相關，高劑量的凝集素可使Hela細胞凋亡或壞死；當凝集素濃度低于IC50值時，Hela細胞以凋亡為主，當凝集素濃度高于IC50值時，Hela細胞以晚期凋亡和死亡為主；此