PEG修飾黑蕓豆蛋白改善其功能特性及降低凝集素致敏性的研究.pdf

1、本課題對黑蕓豆蛋白(BKBPI)及其所含凝集素(LC)進(jìn)行PEG化學(xué)修飾，制備了PEG-BKBPIs及PEG-LCs，研究了PEG修飾前后黑蕓豆蛋白功能特性及致敏性變化，分析了不同分子量PEG-SPA修飾對黑蕓豆凝集素的影響，優(yōu)化了黑蕓豆凝集素的PEG-SPA化學(xué)修飾工藝，評價(jià)了黑蕓豆凝集素及其PEG-SPA修飾產(chǎn)物的穩(wěn)定性。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1、PEG修飾前后黑蕓豆蛋白功能特性及致敏性變化。通過TNBS法及紅外光譜分

2、析黑蕓豆蛋白PEG修飾情況，并測定PEG修飾前后黑蕓豆蛋白的功能性及致敏性。試驗(yàn)結(jié)果表明，PEG-SC、PEG-SPA、PEG-SS均可有效地對黑蕓豆蛋白進(jìn)行PEG修飾，PEG修飾劑與黑蕓豆蛋白的氨基酸均以-CONH-鍵的方式結(jié)合。三種PEG修飾后黑蕓豆蛋白的溶解性、持油性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、起泡穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性及消化穩(wěn)定性均得到有效提高，凝血活性及致敏性均明顯降低，其中PEG-SPA與PEG-SS作用更明顯。
　　2、

3、PEG修飾前后黑蕓豆蛋白凝膠性的變化。利用流變儀對PEG修飾前后黑蕓豆蛋白的成膠濃度及NEM、NaCL、預(yù)熱處理對黑蕓豆蛋白凝膠性的影響進(jìn)行分析。結(jié)果表明，PEG修飾后，黑蕓豆蛋白的成膠濃度由80mg/ml降低至75mg/ml，且成膠強(qiáng)度增大，成膠所需時(shí)間縮短。鹽離子添加及NEM的添加有利于BKBPI及PEG-BKBPIs成膠，當(dāng)鹽離子濃度達(dá)1mol/L時(shí)，BKBPIs的凝膠性減弱。BKBPI及PEG-BKBPIs經(jīng)預(yù)熱處理后，凝膠強(qiáng)度

4、均上升至少116％。
　　3、不同分子量的PEG-SPA修飾對黑蕓豆凝集素的影響。采用不同分子量(5K、10K、20K)的PEG-SPA對黑蕓豆凝集素進(jìn)行修飾，并研究黑蕓豆凝集素在修飾前后的蛋白結(jié)構(gòu)及生物活性。結(jié)果表明，不同分子量的PEG-SPA修飾并未對黑蕓豆凝集素蛋白的二級及三級結(jié)構(gòu)造成顯著影響，PEG修飾后黑蕓豆凝集素的特異性糖親和活性指數(shù)變化差異不明顯，但凝血活性及致敏性急劇降低50％以上，其中PEG-SPA(20K)作用

5、效果最為明顯。
　　4、黑蕓豆凝集PEG-SPA化學(xué)修飾條件優(yōu)化。采用PEG-SPA(20K)為化學(xué)修飾劑，以PEG修飾度及修飾產(chǎn)物活性為指標(biāo)，得到最佳的修飾反應(yīng)條件為:LC與PEG-SPA的添加摩爾比1∶10，反應(yīng)pH7.0，反應(yīng)溫度24℃，反應(yīng)時(shí)間2h。
　　5、修飾前后黑蕓豆凝集素穩(wěn)定性對比研究。對不同的酸堿處理、熱處理、體外模擬消化及貯藏時(shí)間下LC及PEG-LC的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，LC及PEG-LC僅在pH2

6、時(shí)出現(xiàn)較大的生物活性及二級及三級結(jié)構(gòu)變化，其他pH條件下保持穩(wěn)定;80℃以上的加熱處理會破壞LC及PEG-LC的二級及三級結(jié)構(gòu)及生物活性，且PEG-LC在酸堿及加熱處理下結(jié)構(gòu)及活性變化更小，穩(wěn)定性更高。LC及PEG-LC均在模擬胃相被消化，在模擬胰相中保持穩(wěn)定，且PEG-LC更難被消化。LC及PEG-LC分別在30天的貯藏期間最大可出現(xiàn)1400nm及619nm的蛋白質(zhì)聚集顆粒，且LC出現(xiàn)出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集的時(shí)間更早(48h)，因此，PEG-