黑曲霉孢子作為葡萄糖氧化酶生物催化劑的制備和活性測定方法研究.pdf

1、葡萄糖氧化酶(GOD)在食品行業(yè)、畜牧行業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)均有廣泛的應用。以往工業(yè)生產(chǎn)GOD多用黑曲霉整菌發(fā)酵法，該法產(chǎn)生大量的菌絲，發(fā)酵液粘性大，容易聚團，造成通氣效果不好，不利于后續(xù)的反應。再者，發(fā)酵液成分復雜，不利于GOD的分離純化，且分離純化后的GOD極易失活，造成使用成本高。黑曲霉孢子是GOD的天然儲藏庫，其在-20℃下貯存3個月也不會丟失任何GOD活性，開發(fā)其作為GOD生物催化劑，具有轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基成分簡單，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物易于分離，易于工業(yè)

2、化應用等優(yōu)勢，但是黑曲霉孢子的剛性膜結構充當了天然屏障，導致酶與催化底物無法接觸。因此，本論文擬基于其孢內(nèi)GOD活性，開發(fā)其作為轉(zhuǎn)化葡萄糖產(chǎn)葡萄糖酸的生物催化劑，并對開發(fā)其應用所涉及到的相關問題進行初步研究，具體如下:
　　(1)轉(zhuǎn)化葡萄糖產(chǎn)葡萄糖酸的黑曲霉孢子制備方法研究。黑曲霉孢子在未萌發(fā)時所具有的GOD活性更大，需要對孢子萌發(fā)進行抑制;孢子壁具有天然的保護作用，不利于GOD與底物接觸，需要將孢子進行透性處理。采用滴定法研究了

3、不同制備方法獲得的黑曲霉孢子的GOD活性。結果表明，用3％ Citral處理凍融2d的孢子和新鮮的孢子，發(fā)現(xiàn)Citral處理凍融2d的孢子酶的活性更高;相同孢子處理條件，振蕩培養(yǎng)相同的時間后，109 spores/mL普遍比108spores/mL所獲得酶的活性更高。
　　(2)壓電傳感法測定GOD活性?；趬弘妭鞲衅鲗OD專一催化β-D-葡萄糖底物產(chǎn)生葡萄糖酸這一變化過程有靈敏的頻移響應，建立了壓電傳感器測定GOD活性的方法。

4、首先，利用該方法測定了GOD的米氏常數(shù)，將GOD恒定在23.75U，葡萄糖濃度變化范圍為2 mg/mL到40 mg/mL，結果發(fā)現(xiàn)葡萄糖質(zhì)量濃度和初始反應速度呈線性相關，得到GOD的米氏常數(shù)Km=6.01 mg/mL，最大初速度Vm=33.28 Hz/min，該值與文獻報道值接近;利用該法建立GOD濃度與頻移之間的標定方程，將β-D-葡萄糖底物質(zhì)量濃度維持不變，加入不同濃度的GOD，獲得一定酶濃度下的頻移響應曲線，將6 min頻移變化響

5、應曲線的斜率定義為酶的初速度，得到酶濃度與v0之間存在線性關系為v0=1.027[E]+5.214(R2=0.995，n=6)，通過測定v0可知道所測的酶活性。用壓電傳感法測得酶濃度下限為4.75U。運用樣品加標的方法在進行回收率實驗的同時來檢驗方法的精密度，計算得到回收率在94.06％到99.34％之間，且相對標準偏差在4.3％以內(nèi)，表明壓電傳感法測定葡萄糖氧化酶的活性結果準確可靠。
　　(3)壓電傳感法測定黑曲霉孢子生物催化葡

6、萄糖產(chǎn)葡萄糖酸含量。采用壓電傳感法測定了不同制備方法下黑曲霉孢子轉(zhuǎn)化葡萄糖產(chǎn)葡萄糖酸的含量，具體獲得了未經(jīng)任何處理的孢子、沖洗5次的孢子、凍融處理2d的孢子、1％Citral處理孢子、2％Citral處理孢子、3％Citral處理孢子、3％Citral處理凍融2d的孢子生物催化葡萄糖產(chǎn)葡萄糖酸的頻移響應曲線，并建立了頻移與葡萄糖酸含量的關系。結果發(fā)現(xiàn)3％Citral處理凍融2d的孢子反應壓電傳感器的頻移最大，生成的葡萄糖酸最多。同時采用