番茄細菌性潰瘍病菌clavibactermichiganensissubsp.michiganensis實時熒光pcr檢測技術

1、西北農林科技大學碩士學位論文番茄細菌性潰瘍病菌（Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis）實時熒光PCR檢測技術姓名：夏明星申請學位級別：碩士專業(yè)：植物病理學指導教師：馬青20050501R A P I D D E T E C T I o N O F T O M 喳T O C A N K E R D I S E A S E( C l a v i b a c t e r m i c h i

2、g n n e n s i s s u b s p ．m i c h i g a n e n s i s 、)W I T H R E A L ．T I M E F L U o R E S C E N T P C RA b s t r a c tC l a v i b a c t e r m i c h i g a n e n s i s s u b s p ．m i c h i g a n e n s i s i s t h e m o

3、 s t d e s t r u c t i v e b a c t e r i a lp a t h o g e no ft o m a t o ．T h e i n f e c t e d s e e d sa r et h em a j o rw a y t o s p r e a dt h ep a t h o g e nd i s t a n t l y ．E P P Oh a s l i s t e d C m m a sa

4、 nA 2 q u a r a n t i n ep e s t ．T h e t r a d i t i o n a l m e t h o d ss u c ha s ：i s o l a t i o na n d c u l t u r e ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c ．h e m i c a li d e n t i f i c a t i o n ，p h a g es p e

5、 c i f i c i t y , s e r o l o g i c a lt e s ta n dh o s tr e a c t i o n ·w e r e a p p l i e dt o d e t e c t a n di d e n t i f y t h e b a c t e r i u m ．T h e s em e t h o d s a r et i m e - c o n s u m i n g

6、，l o w e f f i c i e n c y ，l o w a c c u r a c y a n ds e n s i t i v i t y , w h i c h c a n n o t m e e tt h ec u s t o m - q u a r a n t i n ee x p e c t a t i o n s ．P C Rw a sa p p l i e d t o d e t e c tt h ep h y

7、 t o p a t h o g e nw i d e l y i nr e c e n t l yy e a r s ，w h i c hi sm o r e r a p i d a n d e f f i c i e n t ．H o w e v e r , t h eg e l e l e c t r o p h o r e s i si sn e e d e dt od e t e r m i n et h es i z e s

8、o f a m p l i f i e d p r o d u c t a f t e rn o r m a lP C R a n dt h ec o n t a m i n a t i o n ，s a f e t ya n dt i m e —c o n s u m i n gp r o b l e m s h a v e b e e n n o t e d a S s i g n i f i c a n t i s s u e s

9、 ．S o a s a f e r , m o r ea c c u r a t e ，s e n s i t i v ea n d r a p i dP C R m e t h o d a r er e q u i r e d f o r p h y t o p a t h o g e nd e t e c t i o n ．T h e s e r i e s o f p r i m e r sa n dT a q m a n p r

10、 o b ew e r ed e s i g n e db a s e d o nt h er e g i o no fI T S t od e t e c tC r a m w i t l ln o r m a l P C R a n d R e a l —T i m ef l u o r e s c e n tP C R ( R T FP C R ) i n t h i se x p e r i m e n t ．T h e s p

11、 e c i f i c p r i m e r sa n dp r o b e sw e r ef o u n dt h a t t h e yc o u l dd e t e c t a l l t h eC r a m i s o l a t e sc o l l e c t e df r o md i f f e r e n ts o u r c e s ．R ep r o t o c o lw a sa p p r o x i

12、 m a t e l y10 0t i m e sm o r es e n s i t i v et h a nn o r m a lP C R a n dt h ea m p l i f i e dp r o d u c t sw e r ec o n f i r m e db ys p e c i f i c f l u o r e s c e n tp r o b eu s e dd u r i n ga m p l i f i

13、c a t i o n ．S t r o n gf l u o r e s c e n t s i g n a l c o u l d b ec o l l e c t e di n t h e r e a c t i o nw h e nt h eD N A w e r e d i r e c t l y e x t r a c t e d f r o m t h e i n o c u l a t e d s e e d a n d

14、s e e d l i n gw h i c h h a dn os y m p t o m ．F u r t h e r m o r e ，t h ep a t h o g e n i s o l a t i o ni s n o t r e q u i r e da n d c o n t a m i n a t i o ni sc o n t r o l l e db e c a u s e ‘t h ew h o l e d e

15、 t e c t i o n p r o c e s s i sf i n i s h e di nt h ec o n t a i n e d t u b e s ．T h i sm e t h o dc a np r o v i d ea s p e c i f i c ，s e n s i t i v e ，r a p i d d e t e c t i o no fC m m f o rq u a r a n t i n ed