實(shí)驗(yàn)酵母蔗糖酶的化學(xué)修飾

1、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)酵母蔗糖酶的化學(xué)修飾酵母蔗糖酶的化學(xué)修飾一、一、原理原理蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的重要方法，對(duì)蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，不僅可以探明酶活性部位的結(jié)構(gòu)，也可為改進(jìn)酶的原有性質(zhì)(如穩(wěn)定性等)提供理論基礎(chǔ)。其中苯甲基磺酰氟可以特異性修飾絲氨酸殘基、三硝基苯磺酸可以特異性修飾賴氨酸殘基、對(duì)氯汞苯甲酸可以特異性修飾巰基、IAc可以特異性修飾組氨酸殘基、N一溴代琥珀酰亞胺可以特異性修飾色氨酸殘基、二硫蘇糖醇可以特異性修飾二硫

2、鍵、EDTA是金屬離子的螯合劑，可與酶活性中心的金屬離子發(fā)生作用二、二、儀器和試劑儀器和試劑1、儀器（1）恒溫水浴鍋（2）電爐（3）722分光光度計(jì)2、試劑（1）苯甲基磺酰氟(PMSF)（2）三硝基苯磺酸(TNBS)（3）對(duì)氯汞苯甲酸(PCMB)（4）IAc（5）N一溴代琥珀酰亞胺(NBS)（6）二硫蘇糖醇(DTT)（7）EDTA（8）0.2molL乙酸緩沖液（pH4.6）（9）0.5molL蔗糖溶液（10）砷鉬酸試劑：將50g鉬酸銨溶

3、于900mL水，邊攪拌邊加入42mL濃硫酸；另取6g砷酸鈉溶于50mL水，加入到前一溶液中，徹底搖勻，定容至1000mL，于37℃下保溫24h，然后在室溫下儲(chǔ)存于棕色瓶中。（11）Nelson試劑：A液：取25g無水碳酸鈉、25g酒石酸鉀鈉，加水溶解后再加入20g碳酸氫鈉、200g無水硫酸鈉，加水定容至1000mL。B液：將15gCuSO45H2O溶于90mL水，滴加2滴濃硫酸，定容至100mL。將A液與B液按50：2的比例（體積比）進(jìn)

4、行混合，即為Nelson試劑，用前需在37℃以上溶解，防止溶質(zhì)析出。三、三、操作步驟操作步驟1、將濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmolL的各種修飾劑0.5mL與酶液0.5mL在37℃下作用20min，測(cè)定其剩余活力，以pH4.6的乙酸緩沖液代替抑制劑溶液測(cè)得的活力為100%。2、以蔗糖為底物，采用Nelsons法測(cè)定蔗糖酶的活力。Nelsons法步驟：1、加入0.2molL乙酸緩沖液0.2mL、0.5molL蔗糖溶液