第五章體內(nèi)藥物分析

1、第五章 體內(nèi)藥物分析,生物樣品特點,1、被測定的藥物和代謝物的濃度低；2、樣品大多需要分離和凈化；3、樣品量少，連續(xù)測定時，很難再度獲得完全相同的樣品。4、工作量較大，5、要求很快地提供結(jié)果(毒物檢測),樣品制備：去除蛋白質(zhì)、綴合物水解、化學衍生化、分離濃集（液液萃取、固相萃取等）；樣品測定：光譜分析法、色譜分析法、免疫分析法、生物學方法方法驗證：特異性、標準曲線和定量范圍、定量下限、精密度與準確度、穩(wěn)定性、提取回收

2、率,體內(nèi)藥物分析：,第一節(jié)、常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏,一、體內(nèi)樣品的種類、采集與制備（一）血樣：血漿、血清血漿：選用最多。因血漿中的藥濃可反映藥物在體內(nèi)的狀況。而且血漿中藥物濃度的數(shù)據(jù)報道較多，可供借鑒。血漿是全血在加肝素、枸櫞酸、草酸鹽等抗凝劑的全血經(jīng)離心后分取，量約為全血的一半。,血漿的制備：采集的靜脈血液置含有抗凝劑的試管中，混合后，以2500?3000r/min離心5?10min使與血球分離，所得淡黃色上清液即為血漿。

3、 抗凝劑—最常用的是肝素（heparin），肝素是體內(nèi)正常成分，因此不會改變血樣的化學組成或引起藥物的變化，一般不會干擾藥物的測定。通常1ml血液需用肝素0.1?0.2mg或20IU(1mg?126IU)?？刹槐販蚀_控制 其它抗凝劑EDTA、枸櫞酸鹽、草酸鹽等，是與血液中的鈣離子結(jié)合的試劑，它們可能引起被測組分發(fā)生變化或干擾某些藥物的測定，不常使用。,血清的制備：采集的靜脈血液置試管中，于37℃或室溫放

4、置30min?1h。血液凝固后，用細竹棒或玻璃棒輕輕剝?nèi)ピ嚬鼙谏系难?，再?500?3000 r/min離心5?10min，上層淡黃色液體即為血清。 現(xiàn)文獻所指血藥濃度為血漿或血清中藥物總濃度（游離的和血漿蛋白結(jié)合的總濃度）。,血漿與血清的區(qū)別,血清比血漿只是少一種纖維蛋白原 一般血漿中藥物濃度與血清中藥物濃度相當血漿比血清的分離快，而且制取量約為全血的50%~60%（血清為全血的50%左右），多數(shù)用血漿進行分析。若血漿中含

5、有的抗凝劑對藥物濃度測定有影響時，則應(yīng)使用血清樣品 。,（二）尿樣：尿樣測定主要用于藥物劑量回收研究、藥物腎清除率和生物利用度等研究，以及測定代謝物類型等。體內(nèi)藥物清除主要是通過尿液排出，藥物可以原型（母體藥物）或代謝物及其綴合物形式排出。尿樣常需加入防腐劑。,成人一日排尿量為1?5L。尿樣包括隨時尿、晨尿、白天尿、夜間尿及時間尿幾種。因尿液濃度變化較大，所以應(yīng)測定一定時間內(nèi)排入尿中的藥物總量。一般采集時間尿（規(guī)定時間內(nèi)采集尿液體積和

6、排入尿中的藥物總量）。 尿液中藥物濃度的改變不能直接反映血藥濃度，即與血藥濃度相關(guān)性較差、尿液量較大不易保存等。,（三）、唾液： 唾液中的藥物濃度通常與血漿濃度相關(guān)。樣品易得，取樣無損害，尤易為兒童接收。有些可從藥物唾液濃度推定血漿中游離藥物濃度。 唾液由腮腺、頜下腺和舌下腺三個主要的唾液腺分泌匯集而成前兩者分泌量占總量90%。兩者中濃度大致相當。 取樣：在潄口后15min，安靜

7、狀態(tài)下采集口腔內(nèi)然流出的唾液；也可在刺激下快速采樣(需注意干擾) 。如口嚼石臘片或?qū)幟仕?、維生素C等置于舌尖，棄去初始部分后采集。刺激后采集的為混合唾液。,藥物在臟器組織中的分布情況，常用胃、肝、腎、肺、心等。制備：測定之前一般需制成勻漿組織樣品的處理：沉淀蛋白法、酸水解法、酶水解法 （蛋白水解酶）,（四）組織：,（五）頭發(fā)：,應(yīng)用— 體內(nèi)微量元素含量測定 — 用藥史的估計 — 臨床用藥和藥物非法濫

8、用的區(qū)別 — 毒性藥物檢測,頭發(fā)樣品的采集：采集枕部發(fā)樣(帶根部），微量元素在前額部位的頭發(fā)中含量最低，枕部含量最高。頭發(fā)樣品的洗滌：除去外源性污染物，推薦使用丙酮-水-丙酮；丙酮浸泡攪拌10min，自來水漂洗3次，再用丙酮浸泡攪拌，自來水、蒸餾水各洗3次。頭發(fā)樣品的處理：直接甲醇提取、酸水解、堿水解、酶水解（葡萄糖醛酸酶）,三、體內(nèi)樣品的貯存與處理,（一）冷藏與冷凍血漿和血清需采集后及時分離，一般最遲不超過2h，分

9、離后再置冰箱或冷凍柜中保存（-20~-80℃）。尿樣應(yīng)立即測定，若收集24h的尿液不能立即測定時，可加入甲苯、氯仿、醋酸等防腐劑，一般可保存24~36h，也可加入疊氮化鈉較長時間保存。唾液在保存過程中會放出二氧化碳使pH值升高。另唾液中含有粘蛋白，須離心后冷藏或冷凍（二）去活性終止酶的活性方法：快速冷凍、微波照射、加入酶活性阻斷劑等。,分析方法與樣品處理步驟的選擇,第二節(jié)、體內(nèi)樣品的的前處理,一、體內(nèi)樣品預(yù)處理的目的 1、

10、使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放出來，以測定藥物的總濃度。 2、介質(zhì)復雜，干擾物多，待測物濃度低，須分離干擾物質(zhì)、富集待測藥毒物 3、為了適應(yīng)和符合測定方法所要求的靈敏度 4、為了防止分析儀器的污染、劣化，提高檢測準確度、精密度和選擇性等。,二、常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法要考慮：藥物的理化性質(zhì)（極性、酸堿性、光譜特性、揮發(fā)性、穩(wěn)定性），藥物測定的目的，選用的生物體液和組織的類型，待測物的濃度范圍，樣品制備與分析技術(shù)的關(guān)系。,

11、（一）、去除蛋白質(zhì),是測定血漿、血清、全血及組織勻漿等樣品中藥物時的最先處理步驟。1、加入可與水混溶的有機溶劑（體積比、pH值） 破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間的氫鍵。常加入乙腈、甲醇、乙醇等，能使與蛋白結(jié)合狀態(tài)的藥物釋放，將混合物超速離心，取上清液作為樣品。,2、加入中性鹽 使蛋白脫水而沉淀，硫酸銨最常用3、加入強酸 與蛋白形成沉淀，陰離子型沉淀劑。如三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸等，在酸性下分解的藥物不宜用本法去蛋白。

12、4、熱凝固法 加熱至90℃蛋白熱變性后離心或過濾除去,（二）分離、純化與濃集 當藥物濃度較低或分析方法的特異性或靈敏度不夠高時，生物樣品需分離、純化與濃集。,1、液相萃取法,溶劑選擇—合適的溶劑是成功的主要條件 ①了解藥物與溶劑的化學結(jié)構(gòu)及其性質(zhì) ②對藥物未電離分子可溶，對電離形式分子不溶 ③沸點低、易揮發(fā)，毒性小與水不相混溶 ④不影響紫外檢測 ⑤具有較高的化學穩(wěn)定性和惰性 ⑥不易乳化,23,提取

13、溶劑：極性相似相溶溶劑的用量：一般有機相與水相之比為1：1~5：1溶液的pH調(diào)節(jié)：最佳pH選擇主要與藥物的pKa值有關(guān)。酸性藥物pH應(yīng)低于藥物pKa值1~2個單位；堿性藥物：pH應(yīng)高于藥物pKa值1~2個單位。提?。哼M行一次（至多二次）提取，濃集：常用吹氮氣使溶劑揮散，或減壓蒸發(fā)（注意暴沸）。,生物樣品宜在堿性或近中性提取，生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)多為酸性，在堿性下不易被萃取出來。,,空白血清在pH2、pH7和pH13三種緩沖液中用

14、乙醚提取，提取液HPLC(220nm)測定，在pH13下提取液中雜質(zhì)峰最少。,液液萃取特點：優(yōu)點：可將大部分內(nèi)源性雜質(zhì)去除；經(jīng)濟實用、可使樣品富集、可一次進行多個樣品萃取 缺點：乳化、污染環(huán)境、 乳化的去除：加少量固體氯化鈉到水相中可減輕乳化；輕微乳化離心；嚴重乳化低溫冰箱快速冷凍破壞乳化層后融化離心。,2、固相萃取法：,以固相分離方法進行樣品預(yù)處理，從水相中分離出所需測定的組份，通常以柱分離方式進行操作，故有時這種

15、方法又稱為固相提取 活化?上樣?淋洗?洗脫 洗脫液濃集,28,固相萃取的模式及原理,,反相固相萃取正相固相萃取離子交換固相萃取,,① 陰離子交換② 陽離子交換,實驗步驟,第一步：用甲醇潤濕小柱，活化填料 第二步：用水或適當?shù)木彌_液沖洗小柱 —除去大部分甲醇 第三步：加樣，使樣品經(jīng)過小柱，棄去廢液 第四步：用水或適當?shù)木彌_液沖洗小柱，去除內(nèi)源性雜質(zhì)

16、 第五步：選擇適當?shù)南疵撊軇┫疵摫环治鑫铮占疵撘?，揮干溶劑，備用或直接進行在線分析 血漿樣品可直接上柱，樣品量0.1~2ml，流速1~2ml/min,31,本法特點：少溶劑、少污染、減少液液萃取的乳化。適合各種液體檢材如血、尿、洗胃液、現(xiàn)場水、飲料等，對于肝、腎、胃以及其他固體檢材，均需制成水液方可進行固相萃取。,柱切換高效液相色譜技術(shù)是指由閥來改變流動相走向與流動相系統(tǒng)，從而使洗脫液在一特定

17、時間內(nèi)從預(yù)處理柱進入分析柱的技術(shù)。 用兩個或兩個以上柱子連接構(gòu)成色譜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，使不同柱子達到不同分離目標，柱子間用切換閥聯(lián)結(jié)，這就是柱切換技術(shù)?；驹硎鞘紫仍陬A(yù)柱上實現(xiàn)生物體液中干擾大分子與待測藥物的分離，然后用柱切換將待測藥物從預(yù)柱轉(zhuǎn)移至分析柱上完成色譜分析。,自動化固相萃取-柱切換高效液相色譜法,3. 超濾法,膜分離技術(shù)，可用于測定生物樣品中游離藥物濃度按照分子截留量的大小，可分離30?1000kD

18、的可溶性生物大分子物質(zhì)?？杉訅哼^濾或高速離心。,（三）、輟合物的水解：,酸水解法：強酸、加熱酶解：常用葡萄糖醛酸酶，一般控制pH4.5~5.5 ，37℃孵育數(shù)小時。溶劑解：,（四）、化學衍生化,1、使藥物變成能被分析的性質(zhì)2、提高檢測靈敏度3、增強藥物穩(wěn)定性4、提高對光學異構(gòu)體分離的能力氣相色譜衍生化液相色譜衍生化,衍生化方法：柱前衍生， 柱后衍生,氣相色譜衍生化方法：硅烷化、?；⑼榛?、不對稱衍生化液相色譜衍生

19、化方法：紫外衍生化、熒光衍生化、電化學衍生化、手性衍生化,第三節(jié)、體內(nèi)樣品分析方法與方法驗證,一、分析方法的建立（一）、分析方法的選擇1、色譜分析法2、免疫分析法3、生物學方法,常用分析方法的特點,,放射免疫,0.001,（二）、分析方法建立的一般程序1、色譜條件的篩選：確定最佳分析檢測條件；色譜柱(型號、牌號、填料性質(zhì)、柱長度)；流動相組分及配比、流速、柱溫、進樣量、內(nèi)標物質(zhì)的濃度及其加入量等；使各物質(zhì)具有足夠的方法靈敏度(

20、LOQ)；良好的色譜參數(shù)(n、R、T)和適當?shù)谋Ａ魰r間(tR)。,2、色譜條件的優(yōu)化：,在進行分離條件篩選時，應(yīng)考察生物基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物對分離與檢測的干擾，步驟如下： 空白溶劑試驗 ——溶劑(方法特異性) 空白生物基質(zhì)試驗 —— 內(nèi)源性物質(zhì)干擾(方法特異性) 模擬生物樣品試驗 —— 方法驗證（效能指標） 3、實際生物樣品測試,二、分析方法的驗證,1．特異性——避免干擾2．標準曲線與線性范

21、圍3．定量限——靈敏度4．精密度與準確度——結(jié)果可重現(xiàn)5．樣品穩(wěn)定性 6．提取回收率7．分析過程的質(zhì)量控制,體外藥物分析,（一）、方法特異性(專屬性或選擇性),方法的特異性(specificity)——又稱專屬性或?qū)Ｒ恍?，通常與選擇性(selectivity)互用——系指當有內(nèi)源性物質(zhì)存在時，方法準確測定待測物質(zhì)的能力專屬性——表示所檢測的信號(響應(yīng))系屬于待測藥物

22、所特有的選擇性——系指將待測物質(zhì)與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分(分離)的能力,考察一個分析方法是否具有特異性，應(yīng)著重考慮以下幾點：1. 內(nèi)源性物質(zhì)的干擾比較——待測藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測信號；2. 代謝產(chǎn)物的干擾比較——模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品的檢測信號；3. 伍用藥物的干擾還要考慮患者可能同時服用藥物(通常為數(shù)有限)的干擾。提供三張色譜圖，空白生物樣品圖、空白加對照、實際生物樣品圖；4.與參比方法的相關(guān)性,（二）

23、、標準曲線與線性范圍,標準曲線（standard curve）——生物樣品中所測定藥物濃度與響應(yīng)的相關(guān)性——除少數(shù)方法（免疫分析法）外，標準曲線通常為線性模式，最小二乘法或加權(quán)最小二乘法回歸。 線性范圍：標準曲線的最高Cmax與最低濃度Cmax/20的區(qū)間——模擬生物樣品的測定結(jié)果應(yīng)達到試驗要求的精密度和準確度,標準曲線要求,標準曲線——用模擬生物樣品（與待測的含藥生物樣品相同的生物基質(zhì)）建立——線性范圍

24、(不包括零點)應(yīng)能覆蓋全部生物樣品的藥物濃度——不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度,標準曲線的繪制,以待測藥物的檢測響應(yīng)(如色譜峰面積或峰高) 或與內(nèi)標物質(zhì)的檢測響應(yīng)的比值(內(nèi)標法)(因變量， y )對模擬血藥濃度 (自變量，x)——求得回歸方程( y＝a＋bx )及其相關(guān)系數(shù)，( ? ) ?≥0.99(色譜法)或≥0.98(生物學方法) 要求最低濃度點的偏差在±20%以內(nèi)、其余各

25、濃度點的偏差在±15%以內(nèi)。,（三）、定量下限,——系指在保證具有一定可靠性(準確度與精密度符合要求)的前提下，能測定出生物樣品中藥物的最低濃度，又稱為方法靈敏度——標準曲線上的最低濃度點(最低濃度點≥LOQ)要求——應(yīng)能滿足測定3～5個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度；準確度在80%～120%；RSD＜20%,（四）、精密度與準確度,方法準確度——系指用該方法測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程

26、度——應(yīng)使用實際生物樣品測定，但實際生物樣品的濃度是未知的，所以通常使用模擬生物樣品測定——一般用相對回收率表示,測定： 取高(接近上限)、中、低（定量下限的3倍以內(nèi)）3個濃度，每一濃度至少5個樣本，與隨行的標準曲線同法測定、計算方法回收率 限度要求：——相對回收率應(yīng)在85%～115% (LOQ附近80%～120%)——RE在±15% (LOQ附近為±20%

27、),方法精密度(precision )——系指每次測定結(jié)果與多次測定的平均值的偏離程度——表示該分析方法的可重復性——反映分析方法的可操作性，是方法驗證的基本要點實際生物樣品的量有限(如血漿，一般為0.5～2ml)——使用模擬生物樣品測定,測定法,照準確度項下方法，取空白生物基質(zhì)(如血漿)數(shù)份，分別在同一批內(nèi)和不同批間制備高、中、低 3個濃度的QC樣品，并分析測定批內(nèi)RSD——每一濃度5個樣品，每個樣品

28、測定1次，用隨行標準曲線分別計算3個濃度及RSD 批間RSD ——每1分析批內(nèi)每一濃度制備1個樣品，每個樣品測定1次；在不同天連續(xù)制備并測定3 個合格的分析批，至少45 個樣品。,限度要求,在藥代動力學和生物利用度研究中對?g/ml級水平的RSD一般應(yīng)≤10%ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)≤15%在LOQ 附近RSD應(yīng)≤20%。,（五）、樣品穩(wěn)定性,穩(wěn)定性——包括短期穩(wěn)

29、定性和長期穩(wěn)定性 生物樣品的存放條件和時間；凍-融循環(huán)(3次），每次冷凍時間應(yīng)在24h以上；復溶溶劑中的穩(wěn)定性,（六）、萃取回收率,萃取回收率與相對回收率的意義不同 萃取回收率——考察生物樣品預(yù)處理過程造成的藥物的損失程度,取空白生物基質(zhì)(如血漿)，照準確度項下方法，制備高、中、低3個濃度的QC樣品(每一濃度至少5個樣品)，每個樣品分析測定1次另取等量的相同3個濃度的標準溶液，用溶解模擬生物樣品經(jīng)提取處理后

30、的殘渣的溶劑稀釋至同體積，同法測定AT——經(jīng)萃取后的QC樣品的檢測信號AS——未經(jīng)萃取的標準溶液的檢測信號,,限度要求,萃取回收率一般應(yīng)≥60%高、中濃度的RSD應(yīng)≤15%低濃度的RSD應(yīng)≤20%。,,（七）、分析過程的質(zhì)量控制 方法考察完畢后作實際生物樣品的測定，用空白生物介質(zhì)加入待測藥物對照品配制已知濃度樣品，考察方法穩(wěn)定性，推薦由獨立的人員配制不同濃度的QC樣品對分析方法進行質(zhì)量監(jiān)控。

31、 每天建立標準曲線用于計算當天測定藥物濃度，并隨行測定高、中、低3個濃度的QC樣品。,（八）、未知生物樣品濃度超出定量范圍的處理 1、濃度高于標準曲線上限：分取部分樣品用相應(yīng)的空白生物介質(zhì)稀釋至方法可測濃度范圍后重新測定。 2、濃度低于定量限：可增加未知樣品的體積，但應(yīng)在相同的條件下制備QC樣品，驗證方法的特異性、準確度、精密度。在藥代測定時刻不必處理，達峰前以0計，達峰后以無法定量（not detectabl