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1、第五節(jié) 藻類和原生動物,最初,藻類和原生動物分別被看作是低等植物和低等動物。主要依據(jù)它們的營養(yǎng)方式進行鑒別,藻類具有葉綠體,營養(yǎng)方式為光能自養(yǎng)(photoautotrophic);原生動物則依靠吞噬營養(yǎng)(phagotrophic)或滲透營養(yǎng)(osmotrophic)。然而,藻類和原生動物之間的區(qū)別從來就沒有完全弄清楚。過于20多年中,對于單細胞真核生物(algae、protozoa、lower fungi)的進化和系統(tǒng)學(xué)研究異?;钴S。
2、在這一時期,許多分類學(xué)的界限被打破,建立了新的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。,,盡管藻類和原生動物沒有真正的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和進化關(guān)系,但一些研究者還是將它們稱為原生生物(protists)或protoctists。而另一些研究者提出的分類系統(tǒng)中,雖然對某些定義和界限作了很大的修改,仍保留了原生動物界(Protozoa),而藻類則分屬于幾個不同的界:植物界(Plantae)、Chromista和原生動物界(Protozoa)。,,盡管如此,“藻類”和“原生
3、動物”在功能和生態(tài)學(xué)意義上仍然是非常有用的,分別定義為光能自養(yǎng)原生生物(photoautotrophic protists)和異養(yǎng)原生生物(heterotrophic protists)。此外, 還要介紹另一群原核生物——藍細菌(cyanobacteria)培養(yǎng)問題。藻類和原生動物都是水生生物。盡管在陸生環(huán)境中(如土壤),也普遍存在藻類和原生動物,地衣則是藻類和真菌的共生體,但是必須有充足的水分,它們才能活動。,,藻類和原生動物在水
4、生環(huán)境中的生態(tài)學(xué)重要性正日益被人們所認(rèn)識。如在許多水生環(huán)境中,藻類是主要的初級生產(chǎn)者(primary producer),在海洋水體中,占總生物量和初級生產(chǎn)力的80%。藻類還是水體質(zhì)量的重要指示生物(bioinducer),用于評估和監(jiān)測水體系統(tǒng)的健康狀況。,,另一方面,需要特別關(guān)注的是,當(dāng)藻類密度達到一定值時,足以形成表面浮膜或引起飲用水變味。水華(藻華)(algal bloom),尤其是微囊藻屬(Microcystis)、顫藻屬(O
5、scillatora)以及其他屬的一些產(chǎn)毒素的藍細菌形成的水華,嚴(yán)重影響到水體的質(zhì)量,尤其是飲用水供應(yīng)部門所要面對的一個嚴(yán)重問題。,,原生動物在海洋食物鏈中是初級生產(chǎn)者的主要消費者;同時又是浮游生物(plankters)的重要食物資源。在沙土、沉積物、有機物污染的水體以及好氧廢水處理工藝中,原生動物是微型藻和細菌的最主要的消費者。它們也是有機物污染和廢水質(zhì)量的指示生物。此外,海洋原生動物形成的赤潮(red tides),伴隨著產(chǎn)生環(huán)境毒
6、理生物學(xué)問題。,,要對上述問題進行深入的研究,必須對有關(guān)的藻類和原生動物進行準(zhǔn)確的鑒定,而鑒定工作常常取決于在實驗室中培養(yǎng)這些生物的能力。獲得藻類和原生動物的純培養(yǎng)是對其進行基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究和開發(fā)利用的基礎(chǔ)。,,一、 分離方法(Isolation Methods) — 富集(enrichment):將一個野外樣品(field sam
7、ple)接種到一個等體積或更大體積的合適培養(yǎng)基中,然后在適宜的條件下進行培養(yǎng)。這樣通過在不同培養(yǎng)基中,進行一系列不同的平行接種,就可將不同的生物選擇出來。,,1)固氮藍細菌(nitrogen-fixing cyanobacteria)的富集:將樣品接種于合適的缺乏氮源的無機鹽培養(yǎng)基(mineral medium)中,如BG11中不加NaNO3(see Table2),就可以選擇出固氮藍細菌(nitrogen-fixing cyanoba
8、cteria); 2)食細菌原生動物(bacterivorous protozoa)的富集:添加蒸煮的大麥、小麥、大米等谷粒,促進細菌的生長,為原生動物提供食物。 3)富集并不能保證獲得單一原生生物的培養(yǎng)物,但可以增加目標(biāo)生物的細胞數(shù)量,有助于對其進一步的分離。,,— 稀釋(dilution):從某種原生生物占優(yōu)勢的樣品中分離該生物, 稀釋法是最有效的。用合適的培養(yǎng)基對樣品進行系列稀釋,
9、然后在適宜的條件下進行培養(yǎng)。在最大稀釋度的培養(yǎng)液中生長的生物很可能就是單一原生生物。 但稀釋法并不能保證獲得的培養(yǎng)物是純系的(clonal),更不可能獲得一個純菌株(axenic strain)。,,— 物理方法(physical mathods):1) 顯微操作法:在解剖顯微鏡下,選擇原生生物的個體單元,用薄壁毛細移液管轉(zhuǎn)移到一個無菌的培
10、養(yǎng)基中,在適宜環(huán)境條件下進行培養(yǎng)。這種方法適合于多種原生生物,特別是那些體積大、移動慢的原生生物的分離。然而這種方法需要技巧和耐心,而且不適于體積微小的原生生物的分離。,,通常,進行一次操作,并不一定能獲得一個單一的純培養(yǎng)物,可以對已分離的細胞進行洗滌和二次轉(zhuǎn)移,多次反復(fù),就能成功地獲得純培養(yǎng)(axenic culture)。,,對于一些體積小、能移動的原生生物,可以利用顯微操作器(micromanipulator)和瓊脂孔穴通道分離
11、技術(shù)相結(jié)合進行分離。 2)其他物理方法:選擇性過濾(selective filtration)、硅酮油平板法(silicone oil plating)、密度梯度離心(density gradient centrifugation)和流式細胞計量術(shù)(flow cytometry)。,,— 瓊脂平板法(agar plating):主要用于藻類、阿米巴(變形蟲)和某些鞭毛藻的分離。,,二、
12、60; 保藏方法(Maintenance Mehtods)1. 藻類(algae)培養(yǎng)基和保藏方式的選擇取決于藻類分離物(isolates)的營養(yǎng)需求和當(dāng)?shù)氐目衫玫脑腺Y源。1)培養(yǎng)基(Media) — BG11(blue-green algal[cyanobacterial] medium)(Table2):為分離和培養(yǎng)藍細菌而設(shè)計的培養(yǎng)基,也適合于多種真核微型
13、藻(eukaryotic microalgae)的培養(yǎng)。,,— JM(Jaworki’s medium)(Table3): 適合于多種淡水和陸生真核藻類的培養(yǎng)。如果在該培養(yǎng)基中添加57g/L NaSiO3.9H2O,也可用于硅藻(diatoms)的保藏。若在該培養(yǎng)基中添加一定量的有機物(醋酸鈉和復(fù)雜氮源),就可用于培養(yǎng)混合營養(yǎng)型和光能異養(yǎng)型藻類。,,— GUI(Guilliard’s f/
14、2 medium): 用于培養(yǎng)多種海水微型藻.2) 定期傳代(periodic subculturing) 在保藏過程中,需要進行定期的傳代培養(yǎng). 一般按0.5-10%的接種量, 將接種物無菌轉(zhuǎn)移(aseptic transfer)到無菌培養(yǎng)基(sterile medium).,,3) 保藏條件( Maintenance conditions)— 最適溫度(optimal temperature):絕大多數(shù)藻類的菌株可
15、 以在15-20℃下保藏;對于一些分離自極端環(huán)境(extreme environments)的菌株,應(yīng)盡可能地采用與其環(huán)境一致的溫度進行保藏;此外,特別要注意保藏溫度不能超過藻類的最高溫度(temperature maximum)。,,— 光照(light):最好采用控溫光照培養(yǎng)箱(illuminated incubators);用冷白熒光管,按照16h-8h的明-暗方式(light-dark regime
16、)進行照射;來自北向窗子的自然光也是非常合適的。對光照水平也有一定的要求,大多數(shù)藻類的光照水平為50μmol光子/m2s左右;而藍細菌的光照水平為<25μmol光子/m2s。,,2. 原生動物(Protozoa) 1)培養(yǎng)基(culture media) 分為四種主要類型:植物浸汁(plant infusions)、土壤浸出物培養(yǎng)基(soil extract-ba
17、sed media)、無機鹽溶液(inorganic salt solutions)、 專一性培養(yǎng)基(specific media) (Table5)。,,— 植物浸汁(plant infusions):植物浸汁用于培養(yǎng)食細菌鞭毛蟲(flagellates)和纖毛蟲(ciliates)。常用的植物材料有:大米、小麥或大麥粒、干草(hay)、萵苣(lettuce)、谷物葉子。用蒸餾水或無機鹽溶液, 按0.1-0.25%(wt/vol)的含
18、量配制。特別要注意,植物材料的量不能過多,否則會促進細菌的過渡生長,而抑制原生動物。對于一些海生原生動物,植物浸汁可用天然或人工海水配制。,,— 土壤浸出物培養(yǎng)基(soil extract-based media):取1份風(fēng)干、過篩、pH7.0的土壤,加入到2份蒸餾水中,15lb/in2滅菌1h,然后放置一周,制備成土壤浸出物儲備液。使用時,根據(jù)需要用蒸餾水或無機鹽溶液稀釋到3-10%(vol/vol),并添加一定量的谷?;蛱?/p>
19、酸鈣。,,— 無機鹽溶液(inorganic salt solutions):無機鹽溶液是一個離子平衡培養(yǎng)基,其離子組成適合于多種原生動物的生長。 但是,由于其缺乏有機營養(yǎng),因此,必須添加一些可食生物或供可食生物生長的有機碳源。無機鹽溶液分為天然和人工合成的兩種類型,天然的無機鹽溶液有淡水、海水、礦泉水等,通過過濾,即可使用;人工合成的無機鹽溶液有Prescott’s 和James’s
20、 solutions .,— 專一性培養(yǎng)基(specific media):為特定目的而設(shè)計的培養(yǎng)基,其最終目的是獲得原生動物的純培養(yǎng)。目前,已經(jīng)獲得了許多原生動物的純培養(yǎng),如鞭毛蟲Astasia、Euglena、Chilomonas,纖毛蟲Tetrahymana、Paramecium。所用的培養(yǎng)基為限定培養(yǎng)基或半限定培養(yǎng)基。它們都含有相對較高濃度的可溶性有機碳源,以便使原生動物能夠通過滲透方式獲取營養(yǎng)物質(zhì);除酵母粉(yeast ext
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