生物發(fā)光標(biāo)記及溫度梯度凝膠電泳分析甲苯降解菌的研究.pdf

1、傳統(tǒng)環(huán)境微生物的研究主要是依賴于純培養(yǎng)，不僅耗時(shí)費(fèi)力,而且不能精確地反映環(huán)境菌群的生存狀況、組成和多樣性。為了不破壞微生物正常生理狀態(tài)，方便而準(zhǔn)確地檢測(cè)分析，發(fā)展了各種生物發(fā)光標(biāo)記技術(shù)，lux酶基因標(biāo)記技術(shù)就是其中一種。Lux基因可作為報(bào)告基因?qū)胧荏w微生物中，其編碼的熒光脂酶能催化生物發(fā)光反應(yīng)發(fā)出蘭綠色光，具有可借助相關(guān)儀器迅速、及時(shí)檢測(cè)，甚至可用肉眼直接觀察到，可在自然狀態(tài)下研究微生物活性等優(yōu)點(diǎn)，從而只需通過(guò)對(duì)發(fā)光的檢測(cè)就可對(duì)微生物

2、在環(huán)境中的生長(zhǎng)、活性、分布等進(jìn)行實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)。因此，轉(zhuǎn)入發(fā)光基因的發(fā)光菌具有極大的應(yīng)用前景，其在環(huán)境檢測(cè)中的應(yīng)用研究受到廣泛關(guān)注。溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）是一種DNA指紋圖譜技術(shù)，可對(duì)長(zhǎng)度一致但堿基序列不同的DNA片段進(jìn)行有效分離。其被廣泛應(yīng)用于各種微生物生態(tài)學(xué)研究，用于分析分子大小相同但序列不同的16S rDNA片段，根據(jù)不同細(xì)菌其核糖體小亞基基因可

3、變區(qū)堿基序列的不同，分析微生物群落結(jié)構(gòu)的組成，目前已發(fā)展成為環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)分析研究的主要手段之一。甲苯（toluene）是苯系化合物中的一種，由于化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)，致使其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境中長(zhǎng)期滯留，對(duì)生物體有較強(qiáng)的急慢性甚至遺傳毒性的危害。近年來(lái)生物修復(fù)技術(shù)因具有投入低、治理效果好以及基本不產(chǎn)生副作用等優(yōu)點(diǎn)，已逐步被應(yīng)用到甲苯污染物的治理工作中。但目前我國(guó)對(duì)于生物修復(fù)的研究多局限于降解菌的常規(guī)分析和污染物降解率的測(cè)定，缺乏對(duì)降

4、解菌投放后活性的檢測(cè)和對(duì)環(huán)境中微生物種群結(jié)構(gòu)影響的分析。本實(shí)驗(yàn)將生物標(biāo)記和TGGE 兩種手段結(jié)合，同時(shí)檢測(cè)降解菌的生長(zhǎng)、活性及其對(duì)環(huán)境中微生物種群結(jié)構(gòu)的影響。 目的: 利用lux發(fā)光標(biāo)記，跟蹤監(jiān)測(cè)馴化的甲苯降解菌在微宇宙中的生長(zhǎng)狀況，并用TGGE技術(shù)分析甲苯生物修復(fù)過(guò)程中微宇宙(Microcosm)菌群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，以期為更加全面地評(píng)價(jià)生物修復(fù)效果提供科學(xué)依據(jù)。 方法: 本實(shí)驗(yàn)室篩選的惡臭假單胞菌(Pseudomo

5、nas putida)菌株，用lux 發(fā)光標(biāo)記并馴化后，投加到模擬甲苯污染微宇宙中，用頂空氣相色譜7d監(jiān)測(cè)甲苯降解情況，并進(jìn)行平板計(jì)數(shù)發(fā)光菌數(shù)及用弱光儀監(jiān)測(cè)發(fā)光降解菌發(fā)光強(qiáng)度的變化，以了解馴化的降解菌在微宇宙的生長(zhǎng)活性及甲苯降解作用。提取7d中微宇宙樣品的總DNA，用通用引物進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溫度梯度凝膠電泳(temperaturegradient gel electrophoresis，TGGE)分析，通

6、過(guò)對(duì)比分析TGGE指紋圖譜的變化，揭示外源微生物對(duì)微宇宙細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的影響。 結(jié)果: 1. LuxAB基因成功轉(zhuǎn)移到惡臭假單胞菌中，其轉(zhuǎn)移率為33％。經(jīng)過(guò)5次的轉(zhuǎn)菌傳代培養(yǎng)，約數(shù)十代以后，其發(fā)光率保持在99％～100％，表明PBBR-lux 質(zhì)粒在惡臭假單胞菌中傳代穩(wěn)定并能穩(wěn)定表達(dá)。 2.被標(biāo)記的惡臭假單胞菌菌落在培養(yǎng)平板上肉眼可見(jiàn)發(fā)光，并可用X 片感光拍照，菌液發(fā)光強(qiáng)度可用弱光儀檢測(cè)。 3.發(fā)光

7、標(biāo)記檢測(cè)及發(fā)光菌落計(jì)數(shù)顯示，投加的外源菌在微宇宙中生長(zhǎng)良好。 4.TGGE 顯示，原水樣中含有可利用甲苯生長(zhǎng)的微生物，水樣+HDM+甲苯組中7d菌落計(jì)數(shù)及OD值檢測(cè)表明總菌群有旺盛生長(zhǎng)，和投加了外源菌組中總菌群的生長(zhǎng)情況相當(dāng)。但氣相色譜結(jié)果顯示，水樣+HDM+甲苯組中7d甲苯降解率僅為40.2％，而投加外源馴化菌后，水樣+HDM+甲苯+馴化菌組7d降解率達(dá)到91.0％。 5.對(duì)微宇宙TGGE圖譜中的主要條帶進(jìn)行回收、

8、重新擴(kuò)增、克隆建庫(kù)、測(cè)序及序列分析可知，所采水樣中主要菌群有大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，在高濃度甲苯環(huán)境中，土著菌群中大腸桿菌生長(zhǎng)減弱，銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌生長(zhǎng)旺盛，投加的外源菌對(duì)微宇宙甲苯環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)變化的影響不大。