細(xì)胞培養(yǎng)學(xué)筆記(3)

1、細(xì)胞培養(yǎng)學(xué)筆記（3）一、正常細(xì)胞培養(yǎng)1.上皮細(xì)胞類培養(yǎng):來(lái)源于外、內(nèi)、中三個(gè)胚層。上皮細(xì)胞培養(yǎng)有三個(gè)難點(diǎn):①需求特殊底物如在底物上涂有膠原底層則利于細(xì)胞生長(zhǎng)②需求特殊培養(yǎng)基③與上皮細(xì)胞相鄰的成纖維細(xì)胞常與上皮細(xì)胞同時(shí)混雜生長(zhǎng)并常壓過(guò)上皮細(xì)胞。純化和延長(zhǎng)上皮細(xì)胞生存期是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵之一。a.表皮細(xì)胞培養(yǎng):(1)取材:切成0.51cm2小塊(2)EDTA處理:室溫置5分鐘(3)冷消化:換入胰蛋白酶中置4℃過(guò)夜(4)分離:取出皮塊表皮與

2、真皮層分開(kāi)(5)溫消化:表皮剪成更小的塊后置入新的胰蛋白酶中37℃再消化3060分鐘(6)用吸管輕輕反復(fù)吹打使成細(xì)胞懸液(7)培養(yǎng)液:過(guò)濾離心吸上清直接加入Eagle液和血清制成細(xì)胞懸液接種入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。b.乳腺組織培養(yǎng):(1)直接培養(yǎng)法:適于培養(yǎng)含纖維少的軟組織在含有少量培養(yǎng)液的容器中將組織切割成碎塊注入離心管中補(bǔ)加少許培養(yǎng)液用吸管吹打片刻置試管架中35min。吸除上層液可排除非腺細(xì)胞成分重復(fù)23次末次處理結(jié)束后向沉降管中再補(bǔ)加培養(yǎng)

3、液用吸管稍吹打立即濾入另管中調(diào)整密度接種入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。(2)膠原酶消化法:適于處理含纖維多的較硬組織其過(guò)程與培養(yǎng)其它組織相同。c.胃上皮細(xì)胞培養(yǎng):(1)取材:取遠(yuǎn)端非病變區(qū)粘膜少許(2)清洗:含慶大霉素和二性霉素的Hanks液漂洗后用鈍器剝離下粘膜剪成lmm3大小(3)消化:在I型膠原酶和透明質(zhì)酸酶中37℃消化80min(4)離心:收集細(xì)胞懸液離心Hanks液漂洗兩次(5)接種:接種入培養(yǎng)板中在16小時(shí)內(nèi)貼壁細(xì)胞呈多角形島狀或片狀生長(zhǎng)

4、以后逐漸聯(lián)接成片。初代培養(yǎng)可維持23周第一周末達(dá)高峰最后逐漸衰退剝落。d.肝細(xì)胞培養(yǎng)：初代組織塊培養(yǎng):取新鮮肝臟先剝除被膜和血管等纖維成分剪成1mm3左右的小塊采用貼壁培養(yǎng)法。一般次日即可出現(xiàn)生長(zhǎng)暈。初代消化法培養(yǎng):(1)把肝組織切成24mm3的小塊用不含鈣鎂的BSS液洗兩次(2)移入1:1胰蛋白酶和膠原酶中4℃冷消化1012h后過(guò)濾(3)收集細(xì)胞:BSS液洗、計(jì)數(shù)、接種培養(yǎng)灌流法:(1)無(wú)菌解剖動(dòng)物取出肝臟BSS洗(2)吸取消化液后把

5、注射器頭插入肝管中結(jié)扎牢固以防漏出注入膽管系統(tǒng)使消化液進(jìn)入肝小葉中消化液在肝內(nèi)停留2030分后吸出消化液的同時(shí)并輕柔壓肝臟以使肝細(xì)胞脫落和消化液吸出(3)待吸凈消化液后注入離心管中離心用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)能獲得較純的肝上皮細(xì)胞。傳代培養(yǎng):待細(xì)胞生長(zhǎng)連接成片后用BSS洗加1:1的0.025%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合附細(xì)胞cm2需接種2.5106ml(9)為純化細(xì)胞接種數(shù)小時(shí)后去除培養(yǎng)液用Eagle液沖洗加新Eagle液培養(yǎng)

6、。3.肌組織細(xì)胞培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng):(1)無(wú)菌取大腿肌切成0.30.5cm(2)胰蛋白酶消化過(guò)濾合成培養(yǎng)基加血清培養(yǎng)為促進(jìn)分化可加1%的胎汁(3)細(xì)胞接種量為2106皿接種在膠原或明膠的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化。心肌細(xì)胞培養(yǎng):(1)受精雞卵溫育每日翻動(dòng)一次孵育912天(2)取雞胎剝出心臟置入皿中用Hanks液洗(3)小心剪除大的動(dòng)靜脈保留心室肌。用組織塊或消化培養(yǎng)法均可。4.神經(jīng)組織細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)方法:(1)剝除腦組織纖維成分漂洗置于Hank

7、s液中腦組織比較柔軟反復(fù)吹打即制備成細(xì)胞懸液(2)把懸液注入離心管中室溫510分鐘后細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊自然下沉脂肪等雜物易漂浮于懸液表層吸除上清可獲較多的細(xì)胞成分(3)向末次沉降物中加入適量營(yíng)養(yǎng)液過(guò)濾計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整好細(xì)胞密度接種培養(yǎng)(4)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合后可用胰蛋白酶消化傳代。二、培養(yǎng)細(xì)胞的分化1.不適應(yīng):細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)所擁有的分化特性減弱或不顯2.脫分化或去分化:即細(xì)胞失掉發(fā)生分化的能力。不適應(yīng)是因生存條件的改變使分化發(fā)生阻抑從分子水平考慮脫分

8、化很可能是基因變異所致因此應(yīng)分析體外培養(yǎng)細(xì)胞分化的改變屬何種性質(zhì)。很多細(xì)胞在培養(yǎng)中的改變只是因培養(yǎng)環(huán)境的改變和分化因子的缺乏導(dǎo)致細(xì)胞分化表達(dá)受阻、分化基因表達(dá)抑制或不充分而已。即便是脫分化也并不意味著細(xì)胞分化能力完全喪失。三、培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)分類1.貼附型:只賴于貼附才能生長(zhǎng)的細(xì)胞稱貼附性細(xì)胞或錨著依存性細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞貼附在支持物上之后易失去它們?cè)隗w內(nèi)時(shí)原有的特征細(xì)胞分化現(xiàn)象常變得不顯著。在形態(tài)上常表現(xiàn)單一化的現(xiàn)象并常反映其胚層起源呈現(xiàn)類似前

9、述“反祖現(xiàn)象”。如來(lái)源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞多呈上皮型來(lái)自中胚層的則易呈成纖維細(xì)胞型顯然與細(xì)胞分化有關(guān)。由于上述原因體外培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)常表現(xiàn)有一般化的傾向。因此在判定培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)時(shí)很難再按體內(nèi)細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)確定。a.成纖維型細(xì)胞:本型細(xì)胞形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相似而得名細(xì)胞體呈梭形或不規(guī)則三角形中央有卵圓形核胞質(zhì)向外伸出23個(gè)長(zhǎng)短不同的突起。細(xì)胞在生長(zhǎng)時(shí)多呈放射狀、火焰狀或旋渦狀走行。除真正的成纖維細(xì)胞外凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織如心肌、平滑肌