細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)

1、細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí),根據(jù)《中華人民共和國(guó)傳染病防治法實(shí)施辦法》規(guī)定： 凡從事致病性微生物實(shí)驗(yàn)的科研、教學(xué)和生產(chǎn)單位，作為各類傳染病菌（毒）研究操作的基本單元，實(shí)驗(yàn)室必須有防止致病性微生物擴(kuò)散的制度和人體防護(hù)措施。 不同危害群的微生物必須在不同的物理性防護(hù)的條件下進(jìn)行操作，一方面防止實(shí)驗(yàn)人員和其他物品受到污染，同時(shí)也防止其釋放到環(huán)境中。,傳染病原危害等級(jí)。第一級(jí)危害群微生物：與人類成人健康和疾病無(wú)關(guān)； （無(wú)或極低的個(gè)

2、體和群體危險(xiǎn)）不太可能引起人或動(dòng)物致病的微生物第二級(jí)危害群微生物：在人類所引起的疾病很少是嚴(yán)重的，而且通常有預(yù)防及治療的方法； （個(gè)體危險(xiǎn)中等，群體危險(xiǎn)低） 實(shí)驗(yàn)室暴露也許會(huì)引起嚴(yán)重感染，但對(duì)感染有有效的預(yù)防和治療措施，并且疾病傳播的危險(xiǎn)有限。 第三級(jí)危害群微生物：在人類可以引起嚴(yán)重或致死的疾病，可能有預(yù)防和治療的方法；第四級(jí)危害群微生物：在人類可以引起嚴(yán)重或致死的疾病，通常無(wú)預(yù)防和治療的方法，如炭疽桿菌、霍亂弧菌、埃博拉病毒、天

3、花病毒等。,隔離的設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)實(shí)施等3個(gè)方面所組成. 根據(jù)其密封程度的不同，分為 P1、P2、P3和P4四個(gè)生物安全等級(jí)。  P是英文protect（保護(hù)）的縮寫。 四級(jí)生物安全（ P4）是生物安全實(shí)驗(yàn)室等級(jí)最高的實(shí)驗(yàn)室，可以有效阻止傳染性病原釋放到環(huán)境中，同時(shí)給研究人員提供生物安全的保證。實(shí)驗(yàn)室可分： 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室——一級(jí)生物安全水平、 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室

4、——二級(jí)生物安全水平、 防護(hù)實(shí)驗(yàn)室——三級(jí)生物安全水平 最高防護(hù)實(shí)驗(yàn)室——四級(jí)生物安全水平。 根據(jù)操作不同危險(xiǎn)度 ，等級(jí)微生物所需的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)特點(diǎn)、建筑構(gòu)造、防護(hù)設(shè)施、儀器、操作以及操作程序來(lái)決定實(shí)驗(yàn)室的生物安全水平。有關(guān)的手冊(cè)有敘述： 與不同危險(xiǎn)度等級(jí)相對(duì)應(yīng)的（而非“等同的”）各危險(xiǎn)度等級(jí)微生物所要求的實(shí)驗(yàn)室生物安全水平。,生物安全實(shí)驗(yàn)室（P1、P2、P3、P4）,1 級(jí)

5、60;基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室—— 一級(jí)生物安全水平基礎(chǔ)的教學(xué)、研究,GMT 不需要；開(kāi)放實(shí)驗(yàn)臺(tái),2 級(jí) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室——二 級(jí)生物安全水平 初級(jí)衛(wèi)生服務(wù)； 診斷、研究 GMT 加防護(hù)服、生物危 害標(biāo)志 開(kāi)放實(shí)驗(yàn)臺(tái)，此外需 BSC 用于防護(hù)可能生 成的氣溶膠,,3 級(jí) 防護(hù)實(shí)驗(yàn)室——三 級(jí)生物安全水平特殊的診斷、研 究 ，在二級(jí)生物安全防護(hù)水平上增加特殊防護(hù)服、 進(jìn)

6、入制度、定向氣流BSC 和／或其他所有實(shí)驗(yàn)室工作所需要的基本設(shè)備,4 級(jí) 最高防護(hù)實(shí)驗(yàn)室——四級(jí)生物安全水平 危險(xiǎn)病原體研究在三級(jí)生物安全防護(hù)水平上增加氣鎖入口、出 口淋浴、污染物品的特殊處理 Ⅲ級(jí)BSC 或Ⅱ級(jí)BSC。穿著正壓服、雙開(kāi)門高壓滅菌器（穿過(guò)墻體）、經(jīng)過(guò)濾的空氣。 BSC ：生物安全柜；GMT ：微生物學(xué)操作技術(shù)規(guī)范,我國(guó)在生物安全方面也制定過(guò)一些

7、相應(yīng)的條例和法規(guī)。中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（ WS233－2002）《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》中對(duì)生物安全三級(jí)（ P3）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了規(guī)定。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)該采用“安全手冊(cè)”或“操作手冊(cè)”，其中定義了已知的和潛在的危害，并規(guī)定了特殊的操作程序來(lái)避免或盡量減小這種危害。規(guī)范的微生物學(xué)操作技術(shù)是實(shí)驗(yàn)室安全的基礎(chǔ)，而專門的實(shí)驗(yàn)設(shè)備僅僅是一種補(bǔ)充，絕不能替代正確的操作規(guī)范。,在一級(jí)生物安全水平操作的微生物不

8、太可能引起人類疾病或獸醫(yī)學(xué)意義的動(dòng) 物疾病。但理想的做法是，所有實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)進(jìn)行上崗前的體檢，并記錄其病史。疾病和實(shí) 驗(yàn)室意外事故應(yīng)迅速報(bào)告，所有工作人員都應(yīng)意識(shí)到應(yīng)用規(guī)范的實(shí)驗(yàn)室操作技術(shù)的重要性。 在二級(jí)生物安全水平操作微生物的實(shí)驗(yàn)室工作人員 1 、必須有錄用前或上崗前的體檢。記錄個(gè)人病史，并進(jìn)行一次有目的的職業(yè)健康評(píng)估。 2 、實(shí)驗(yàn)室管理人員要保存工作人員的疾病和缺勤記錄。 3

9、60;、育齡期婦女應(yīng)知道某些微生物（如風(fēng)疹病毒）的職業(yè)暴露對(duì)未出生孩子的危害。,培訓(xùn),人為的失誤和不規(guī)范的操作會(huì)影響所采取的安全措施對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員的防護(hù)效果。因此，熟悉如何識(shí)別與控制實(shí)驗(yàn)室危害的、有安全意識(shí)的工作人員，是預(yù)防實(shí)驗(yàn)室感染、差錯(cuò)和事故的關(guān) 鍵。 管理者應(yīng)確保將安全的實(shí)驗(yàn)室操作及程序融合到工作人員的基本培訓(xùn)中。所有實(shí)驗(yàn)室工作人員都會(huì)經(jīng)常遇到的高危操作，包括： 1 、吸入危險(xiǎn)（氣溶膠產(chǎn)物），如使用接種環(huán)、

10、劃線接種瓊脂平板、移液、制作涂片、打開(kāi)培養(yǎng)物、采集血液／血清標(biāo)本、離心等 2 、食入危險(xiǎn)，如處理標(biāo)本、涂片以及培養(yǎng)物 3 、在使用注射器和針頭時(shí)刺傷皮膚的危險(xiǎn) 4 、處理動(dòng)物時(shí)被咬傷、抓傷 5 、處理血液以及其他有潛在病理學(xué)危害的材料 6 、感染性材料的清除污染和處理。,典型的二級(jí)生物安全水平實(shí)驗(yàn)室 門保持關(guān)閉并貼上適當(dāng)?shù)奈ｋU(xiǎn)標(biāo)志。潛在被污染的廢棄物同普通廢

11、棄物隔開(kāi)。 基本生物安全設(shè)備 1 、移液輔助器——避免用口吸的方式移液 2 、生物安全柜，在以下情況使用： —— 處理感染性物質(zhì)；如果使用密封的安全離心杯，并在生物安全柜內(nèi)裝樣、取樣，則 這類材料可在開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室離心 —— 空氣傳播感染的危險(xiǎn)增大時(shí) —— 進(jìn)行極有可能產(chǎn)生氣溶膠的操作時(shí)（包括離心、研磨、混勻、劇烈搖動(dòng)、超聲破碎、打開(kāi)內(nèi)部壓力和周圍環(huán)境壓力不同的盛放有感染

12、性物質(zhì)的容器、動(dòng)物鼻腔接種以及從動(dòng)物或卵胚采集感染性組織）。 3 、一次性塑料接種環(huán)，也可在生物安全柜內(nèi)使用電加熱接種環(huán)，以減少生成氣溶膠。 4 、螺口蓋試管及瓶子。 5 、用于清除感染性材料污染的高壓滅菌器或其他適當(dāng)工具。 6 、一次性巴斯德塑料移液管，盡量避免使用玻璃制品。 7 、在投入使用前，像高壓滅菌器和生物安全柜等設(shè)備必須用正確方法進(jìn)行驗(yàn)收。應(yīng)參照生產(chǎn)商的說(shuō)明書定期檢

13、測(cè)。,廢棄物處理,首要原則：所有感染性材料必須在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)清除污染、高壓滅菌或焚燒。  用以處理潛在感染性微生物或動(dòng)物組織的所有的實(shí)驗(yàn)室物品，在被丟棄前應(yīng)考慮的主要問(wèn)題有： 1 、是否已采取規(guī)定程序?qū)@些物品進(jìn)行了有效的清除污染或消毒？ 2 、丟棄已清除污染的物品時(shí)，是否會(huì)對(duì)直接參與丟棄的人員，或在設(shè)施外可能接觸到丟棄物的人員造成任何潛在的生物學(xué)或其他方面的危害？ 3.清除污染 高

14、壓蒸汽滅菌是清除污染時(shí)的首選方法。需要清除污染并丟棄的物品應(yīng)裝在容器中。任何高壓滅菌后重復(fù)使用的污染（有潛在感染性）材料不應(yīng)事先清洗，任何必要的清洗、修復(fù)必須在高壓滅菌或消毒后進(jìn)行。 也可采用其他除去／或殺滅微生物的替代方法 4.污染性材料和廢棄物的處理和丟棄程序 要對(duì)感染性物質(zhì)及其包裝物進(jìn)行鑒別并分別進(jìn)行處理，相關(guān)工作要遵守國(guó)家和國(guó)際規(guī)定。,合適的環(huán)境和必需的條件,,1,營(yíng)養(yǎng)需要,,2,環(huán) 境 要 求,,,,3,無(wú)毒

15、及無(wú)污染,,,,無(wú) 毒：無(wú)毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必需條件。凡與 細(xì)胞直接或間接接觸的東西都必須 是無(wú)毒的。,無(wú)污染,,微生物的污染,不同細(xì)胞類型的交叉污染,,細(xì)菌,霉菌,支原體等,實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備,實(shí)驗(yàn)用品：超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器液氮罐自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板， 凍存

16、管,,日本三洋CO2培養(yǎng)箱,倒置像差生物顯微鏡,超凈工作臺(tái),自動(dòng)雙重純水蒸餾器 純水儀,濾 器,酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器,培 養(yǎng) 板 及瓶,清洗,在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細(xì)胞殘留物非營(yíng)養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品玻璃器皿的清洗膠塞的清

17、洗塑料制品的清洗,玻璃器皿的清洗,包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個(gè)步驟 浸泡（自來(lái)水）、刷洗（洗衣粉）、流水沖洗、 60℃烘干、酸泡（24小時(shí)）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、60℃烘干清洗后的玻璃器皿干凈透明無(wú)油跡不能殘留任何物質(zhì),浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運(yùn)輸過(guò)程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對(duì)細(xì)胞有害的物

18、質(zhì)等先用自來(lái)水簡(jiǎn)單刷洗，然后用5％稀鹽酸液浸泡過(guò)夜，以中和其中的堿性物質(zhì)再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過(guò)的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上,刷洗：用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)刷洗要適度，過(guò)度會(huì)損害器皿表面光澤度,浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中清潔液對(duì)玻璃器皿無(wú)腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)浸泡時(shí)器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液

19、面浸泡時(shí)間：一般為過(guò)夜，不應(yīng)少于6 小時(shí)清潔液 常用三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml） 強(qiáng)清潔液 63∶1000∶200 次強(qiáng)清洗液 120∶ 200∶1000 弱清潔液 100∶ 100∶1000配制時(shí)應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分配制過(guò)程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成

20、后清潔液一般為棕紅色,沖洗在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或清潔液的殘跡最好用洗滌裝置如用手工操作需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5 次，晾干備用,膠塞的清洗,新購(gòu)置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來(lái)水沖洗，再做常規(guī)處理常規(guī)清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分鐘（以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)），自來(lái)水沖洗，蒸餾水沖洗2-3次，晾干備

21、用,塑料制品的清洗,塑料制品現(xiàn)多是采用無(wú)毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開(kāi)包裝即可用，多為一次性物品必要時(shí)用2% NaOH 浸泡過(guò)夜，用自來(lái)水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30 分鐘，最后用自來(lái)水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用 本實(shí)驗(yàn)： 自來(lái)水洗、蒸餾水洗、蒸餾水煮、甩干水、干燥、裝盒； 消毒。,消毒,細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染常見(jiàn)原因：操作間或周圍空間的不潔培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格

22、或不徹底由于有關(guān)培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染,消毒滅菌方法,物理消毒滅菌法紫外線：用于空氣，操作臺(tái)表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒的培養(yǎng)器皿，30min濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121℃，20min干烤：160℃, 2 小時(shí)過(guò)濾：0.22μm化學(xué)消毒滅菌法70%酒精主要用于操作者的皮膚，操作臺(tái)表面及無(wú)菌室內(nèi)的壁面處理1‰新潔爾滅主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室

23、壁面的擦試消毒抗生素主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染,細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇,選擇培養(yǎng)基沒(méi)有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考： (1 ）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購(gòu)買細(xì)胞株時(shí)咨詢。 (2) 其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。 (3) 根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來(lái)選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選 RPMI1640 。 (4) 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，

24、觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、McCoys 5A、M199、F10等,制備1000mlRPMI 1640培養(yǎng)基,RPMI 1640 干粉培養(yǎng)基10.4g（1包） 蒸餾水 400ml 　　　↓　 磁力攪拌至完全溶

25、解  　　　↓　 加三蒸餾水定容至1000ml 在超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下，用滅菌后的并置有0.22μm孔徑濾膜的過(guò)濾器除菌，并分裝成200ml/瓶，-20℃保存?zhèn)溆谩?用前取一瓶溶解，每200ml培養(yǎng)液加滅活的小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。再加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100U/ml。 ------- 細(xì)胞培養(yǎng)液,胰蛋白酶溶液： 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去

26、細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。 胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。 用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用,稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks 平衡鹽溶液調(diào)成糊狀，再補(bǔ)足D-Hanks 平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4 小時(shí)或冰箱過(guò)夜，不斷攪拌振蕩次日，先用濾紙粗濾，再進(jìn)行過(guò)濾除菌，分裝入瓶中， -

27、20℃保存?zhèn)溆茫ㄒ悦夥纸馐В?，常用濃度?.25% （0.1%-0.5%）胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 至7.2 左右,胰蛋白酶溶液配制,D-Hanks’ 平衡鹽溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS),血清,熱滅活：56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清熱滅活目的：滅活血清中的補(bǔ)體成分。如果不做細(xì)胞因子和免疫相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，建議血清不要滅活。  因?yàn)闊崽?/p>

28、理會(huì)造成血清沉淀物顯著增多，還會(huì)影響血清的質(zhì)量。滅活后嚴(yán)重影響細(xì)胞生長(zhǎng)速度，且細(xì)胞貼壁率降低。血清中的沉淀物絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理顯微鏡下“小黑點(diǎn)”：經(jīng)過(guò)熱處理過(guò)的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點(diǎn)”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立

29、即停止使用，更換另一批號(hào)的血清,血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ℃ ，30 分鐘血清的消毒：過(guò)濾除菌,EDTA·4Na 溶液,一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價(jià)格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。注意：使用E

30、DTA 處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA 會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)EDTA 溶液配制：用D-Hanks’ 平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，4℃冰箱保存,消化液,分離組織和分散細(xì)胞常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液?jiǎn)为?dú)或混合使用,pH 調(diào)整液,NaHCO3 溶液常用濃度為7.5%。配制時(shí)用三蒸水溶解后，過(guò)濾除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保存HEPES（分子量238.31）溶液一種弱酸，中文名

31、字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性主要作用:防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開(kāi)放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES使用終濃度一般為10-50mmol/L常配成1M 儲(chǔ)存液：用20ml 雙蒸水溶解4.76克HEPES，過(guò)濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4℃保存。使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入2ml HE

32、PES濃縮液，終濃度為20mmol/L,抗菌素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。 慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定,器材和液體的準(zhǔn)備,細(xì)胞培養(yǎng)用的玻璃器材培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，160℃，2小時(shí)干烤或15磅，121℃，

33、20分鐘蒸氣滅菌后備用手術(shù)器材、瓶塞、配制好的PBS液15磅，121℃，20分鐘蒸氣滅菌MEM培養(yǎng)液、小牛血清、消化液用G6濾器負(fù)壓抽濾后備用,完全培養(yǎng)基的組成,基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80％一95％血清 5％一20％碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素

34、 各100卑位／毫升,無(wú)菌操作中的注意事項(xiàng),在無(wú)菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無(wú)菌清潔操作前無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘操作時(shí)，小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用 在整個(gè)無(wú)菌操作過(guò)程中都應(yīng)