Lat1在妊娠小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程的功能研究.pdf

1、背景：L-型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（lat1）主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)大的、中性氨基酸，并選擇性的表達(dá)在人胎兒的肝臟、胎盤、大腦等組織中。胚胎植入和蛻膜化對成功的妊娠至關(guān)重要。小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化發(fā)生在妊娠D4晚上22：00-24：00的囊胚著床后，圍繞植入胚胎周圍的基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的廣泛的增殖和分化，這一過程被稱為蛻膜化。母體蛻膜細(xì)胞在母-胎對話中扮演著多功能作用，如：母-胎免疫耐受和胎盤發(fā)育等。而研究表明氨基酸在胚胎植入前/后的胚胎和胎盤發(fā)育中扮演著重要的

2、作用，并且成功的胚胎植入和胎盤形成需要激活的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，除此之外，在胎盤形成進(jìn)程中l(wèi)at1在滋養(yǎng)層巨細(xì)胞的侵襲表型中扮演著一定的作用，然而，lat1在胚胎植入時(shí)蛻膜化進(jìn)程的母-胎對話中與卵巢激素之間的相互作用還有待證明。
　　目的：以妊娠D4-8小鼠為研究對象，從離體、體內(nèi)兩方面研究lat1在小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中所扮演的作用。
　　方法：
　　1.RT-PCR、免疫組織化學(xué)、Western Blot方法檢測la

3、t1在妊娠D4-8小鼠子宮中的表達(dá)。
　　2.體外水平建立小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)蛻膜化模型,轉(zhuǎn)染lat1過表達(dá)質(zhì)?；蚋蓴_質(zhì)粒，Western Blot方法檢測誘導(dǎo)72h時(shí)蛻膜化基質(zhì)細(xì)胞中prl蛋白的表達(dá)變化；亮氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)競爭性抑制劑BCH（濃度分別為0μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、2μM和4μM）干預(yù)后觀察誘導(dǎo)72h的蛻膜化基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化，同時(shí)Western Blot方法檢測細(xì)胞prl蛋白的表達(dá)。
　　3.妊

4、娠D4子宮角注射BCH（濃度分別為50μg/ml、5μg/ml），對照分為溶劑1mol/L氨水處理組及空白對照組，于妊娠D8時(shí)，采用H&E染色法檢測其對子宮蛻膜化的形態(tài)學(xué)影響。
　　4.妊娠D4子宮角注射BCH（濃度分別為50μg/ml、5μg/ml），對照分為溶劑1mol/L氨水處理組及空白對照組，采用免疫組化檢測其對妊娠D8子宮植入位點(diǎn)prl表達(dá)區(qū)域及相對含量的變化；收集D8子宮植入位點(diǎn)組織，Western Blot方法檢測其

5、對prl蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1.D4時(shí)，lat1主要分布在子宮腔上皮、腺上皮和內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中，D5開始，lat1在蛻膜基質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中的表達(dá)水平增加，D6時(shí)，lat1主要表達(dá)在初級蛻膜帶的蛻膜細(xì)胞和胚胎中，D7和D8時(shí)，lat1主要定位在次級蛻膜帶的蛻膜細(xì)胞的胞質(zhì)和胚胎中。Lat1 mRNA和蛋白表達(dá)于妊娠小鼠D4-D8子宮，且在小鼠子宮非植入位點(diǎn)（IIS）的表達(dá)水平低于植入位點(diǎn)；與D4相比，妊娠D5-D8

6、植入位點(diǎn)處Lat1 mRNA和蛋白表達(dá)水平呈上升趨勢，在D8達(dá)到峰值（P＜0.05），而非植入位點(diǎn)表達(dá)無差異。
　　2. Western Blot結(jié)果顯示：體外誘導(dǎo)蛻膜化進(jìn)程中轉(zhuǎn)染lat1過表達(dá)質(zhì)粒后，能促進(jìn)lat1蛋白在蛻膜化基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)能顯著上調(diào)prl蛋白在誘導(dǎo)72h時(shí)蛻膜化基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平；轉(zhuǎn)染篩選后的Lat1-siRNA1有效干擾質(zhì)粒后，能顯著抑制prl蛋白在誘導(dǎo)72h時(shí)蛻膜化基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平（P＜0.05

7、）。
　　3. BCH處理后，誘導(dǎo)72h時(shí)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化多核化比例降低；Western Blot結(jié)果顯示：BCH能顯著降低lat1蛋白在誘導(dǎo)72h時(shí)蛻膜化基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)含量，同時(shí)prl的表達(dá)水平也出現(xiàn)下調(diào)趨勢，并與BCH濃度呈劑量依賴關(guān)系，4μM BCH能顯著抑制prl在蛻膜化基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)（P＜0.05）。
　　4. H&E染色后顯示，與空白組比較50μg/ml和5μg/ml BCH處理組的妊娠D8子宮植入位點(diǎn)的蛻膜區(qū)

8、域減?。≒＜0.05），而氨水處理組無明顯變化,但各組之間不同功能蛻膜區(qū)所占比例和胚胎植入數(shù)量無顯著差異。
　　5.與空白對照組相比，BCH能降低妊娠D8子宮植入位點(diǎn)prl陽性表達(dá)細(xì)胞的積分光密度(P＜0.05），同時(shí)Western Blot結(jié)果顯示，BCH能有效降低妊娠D8子宮植入位點(diǎn)lat1的表達(dá)，prl蛋白在妊娠D8子宮植入位點(diǎn)的表達(dá)水平受到抑制（P＜0.05），而氨水處理組無明顯差異。
　　結(jié)論：Lat1在離體與在體