小鼠子宮內(nèi)膜mRNAs和miRNAs時(shí)空表達(dá)與胚胎著床的關(guān)系及SPOP對基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的影響.pdf

1、第一部分:小鼠子宮內(nèi)膜mRNAs和miRNAs的時(shí)空表達(dá)與胚胎著床的相關(guān)性研究
　　目的：胚胎圍著床是一個(gè)動(dòng)態(tài)的生理過程，這一過程被分成三個(gè)階段，分別是容受前期、容受期和胚胎著床期。整個(gè)胚胎圍著床過程子宮內(nèi)膜形態(tài)和分子發(fā)生顯著改變。子宮內(nèi)膜在不同時(shí)間，不同部位基因差異表達(dá)是引起細(xì)胞組織形態(tài)和分子變化的原因，同時(shí)這也確保了胚胎成功的著床。microRNA（miRNA）是重要的調(diào)節(jié)分子，miRNA主要在細(xì)胞、組織的增殖、分化、凋亡等生

2、理過程中發(fā)揮作用。而在胚胎著床過程中miRNA同樣發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，miRNAs的對基因的調(diào)節(jié)作用決定了基因差異表達(dá)的形成。動(dòng)態(tài)分析胚胎著床過程中mRNA譜和microRNA譜的變化特征，可以為全面理解和闡釋胚胎動(dòng)態(tài)著床過程中的機(jī)制提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)支持。
　　方法：分別收集容受前期、容受期和胚胎著床期子宮內(nèi)膜組織，對應(yīng)于小鼠孕第一天（d1）、孕第四天（d4）和孕第五天著床點(diǎn)(d5IS)和孕第五天著床旁(d5IIS)的昆明小鼠子宮內(nèi)

3、膜組織。采用Trizol法提取樣本總RNA。采用深度測序技術(shù)檢測小鼠子宮內(nèi)膜不同時(shí)期（d1、d4和d5）或不同部位（d5IS和d5IIS）的mRNA和microRNA的表達(dá)情況。采用RT-PCR檢測隨機(jī)選擇的miRNA和mRNA表達(dá)水平是否與NGS檢測的結(jié)果一致。通過NGS測序獲得小鼠孕d1、d4、d5IS和d5IIS的mRNA表達(dá)譜，并將四組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩成對比較，篩選出顯著性差異表達(dá)基因，采用維恩圖對小鼠圍著床期基因表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。

4、通過NGS測序獲得小鼠d1、d4、d5IS和d5IIS的miRNA表達(dá)譜，通過兩兩成對比較獲得顯著性差異的miRNAs，再利用Targetscan database、miRanda database和DIANA-microT3.0三種軟件預(yù)測miRNA的靶向基因，最后預(yù)測結(jié)果采取交集定為最終的靶基因。利用mRNA譜確定靶基因的表達(dá)量，同時(shí)結(jié)合miRNA表達(dá)量篩選出miRNA與對應(yīng)靶向基因是否具有負(fù)向調(diào)節(jié)的關(guān)系。
　　結(jié)果：NGS檢

5、測的miRNAs結(jié)果表明d1、d4、d5IS和d5IIS的miRNAs表達(dá)具有顯著差異，其中d1和d5IS組織中以上調(diào)miRNAs表達(dá)為主；而d4組織中以下調(diào)的miRNAs表達(dá)為主。提示在圍著床期miRNAs具有不同的作用。對顯著差異表達(dá)的63個(gè)miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測，獲得5720個(gè)靶基因。結(jié)合miRNAs譜和mRNAs譜的表達(dá)水平，在d1、d4、d5三個(gè)時(shí)間點(diǎn)共篩選出1473對miRNA-mRNA呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性表達(dá)，而在d1、d4、

6、d5三個(gè)時(shí)間點(diǎn)miRNA-mRNA表達(dá)量都始終保持負(fù)相關(guān)的有138對。在負(fù)相關(guān)表達(dá)的miRNA-mRNA對中隨機(jī)選取5對miRNA-mRNAs利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行檢測miRNA-mRNAs各自的表達(dá)量，驗(yàn)證了NGS檢測的miRNA和mRNA數(shù)據(jù)譜可靠性，同時(shí)證明了在圍著床期miRNA-mRNA存在負(fù)相關(guān)性，表明miRNA對mRNA具有調(diào)控作用。根據(jù)miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)圖分析，表明了miRNAs對mRNAs的調(diào)節(jié)作用。同

7、時(shí)揭示了與容受態(tài)功能相關(guān)的Bcl-2,Klf13和PGR基因是網(wǎng)絡(luò)圖中核心miRNA:mmu-miR-106a-5p,mmu-miR-200b-3p,mmu-miR-96-5p的靶基因。
　　結(jié)論：NGS檢測的mRNAs結(jié)果表明孕d1、d4、d5IS和d5IIS的mRNA表達(dá)具有顯著時(shí)空差異性，這種表達(dá)差異決定了圍著床期子宮內(nèi)膜在不同時(shí)期和部位發(fā)揮不同作用。在胚胎著床時(shí)miRNAs對mRNAs表達(dá)存在調(diào)控作用。而這種調(diào)節(jié)方式在圍著

8、床期的整個(gè)過程持續(xù)發(fā)揮作用。多個(gè)與與容受態(tài)相關(guān)的Bcl-2, Klf13和PGR基因是核心miRNA的靶基因表明miRNAs在小鼠子宮內(nèi)膜容受狀態(tài)的形成和維持早期妊娠中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分:SPOP對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的影響
　　目的：子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜分化是成功實(shí)現(xiàn)胚胎著床的重要過程，受雌孕激素調(diào)節(jié)的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞在這一過程發(fā)生明顯的增殖、分化。我們前期研究證明，SPOP在胚胎著床第5天的著床點(diǎn)和著床旁組織

9、中表達(dá)存在顯著差異，而SPOP與泛素化作用密切相關(guān)。關(guān)于泛素化與胚胎著床的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。因此，本課題著眼于小鼠圍著床期SPOP研究，揭示SPOP在胚胎著床過程中發(fā)揮的作用。
　　方法：建立昆明小鼠早孕模型、小鼠假孕模型、人工激素調(diào)控的小鼠模型。采用定量RT-PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測SPOP mRNA或蛋白在各種模型小鼠（早孕小鼠，假孕小鼠和激素調(diào)控）子宮內(nèi)膜中表達(dá)規(guī)律。采用siRNA構(gòu)建人工誘導(dǎo)

10、蛻膜細(xì)胞SPOP敲除模型。siRNA敲除SPOP后，檢測蛻膜化細(xì)胞蛻膜標(biāo)志物的表達(dá)情況。利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測SPOP對凋亡作用的影響。
　　結(jié)果：SPOP在圍著床期呈波動(dòng)表達(dá)d1、d2和d3表達(dá)較低，從d4到d6表達(dá)顯著增加，d7表達(dá)出現(xiàn)回落。假孕小鼠模型中SPOP具有同樣波動(dòng)表達(dá)的模式。人工誘導(dǎo)蛻膜化后小鼠子宮內(nèi)膜SPOP表達(dá)顯著增加。利用激素調(diào)控小鼠模型證實(shí)SPOP的表達(dá)受雌激素和孕激素的調(diào)控。siRNA敲除SPOP后基質(zhì)蛻膜