tlc板技術(shù)經(jīng)驗交流

1、TLC薄層層析技術(shù),Thin-Layer Chromatography,2,一、 TLC簡介 二、操作過程三、 擴展及用途四、問題討論,主要內(nèi)容：,背景：薄層色譜法(Thin-Layer Chromatography,簡稱TLC）是Kirchner等人在五十年代從經(jīng)典柱色譜法及紙色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來 的一 種 色 譜技術(shù)。六 十年代后，Stahl等人 對薄層色譜法的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)格化及擴大應(yīng)用等方面進行了許多工作，使該法日趨成

2、熟。2010年版中國藥典一部有3341項鑒別采用TLC法分類：按薄層色譜使用的固定相的性質(zhì)及其分離機制可分為吸附薄層、分配薄層、離子交換薄層及分子排阻薄層,背景和分類,4,原理: 利用吸附劑(硅膠)對樣品中各組分 吸附能力 不同，及展開劑對它們的解吸附能力 的不同，使各組分達到分離的目的。,特點：微量、快速、簡單、節(jié)省,一般認(rèn)為TLC是一種定性和半定量的方法,原理和特點,5,操作過程,氧化鋁

3、有弱堿性 pH=9、酸性pH=4及中性pH=7.5三種氧化鋁。弱堿性氧化鋁用來分離中性或堿性化合物；中性氧化鋁適用于酸性及對堿不穩(wěn)定的化合物的分離；酸性化合物可用酸性氧化鋁分離。硅藻土、纖維素、葡聚糖凝膠等化學(xué)鍵合固定相（C18、C8 等）,薄層板,硅膠 表面帶硅醇基（－Si－OH），呈弱酸性 (pH=4.5)，活性硅膠適合分離酸性或中性化合物，如酚類、有機酸、醛類、甾體化合物以及氨基酸類，是基于吸附作用；非活

4、性硅膠含有一定的水，在分離色素時是基于分配作用。,硅膠G: 是含有13％煅石膏（gypsum）黏合劑的硅膠硅膠H：不含黏合劑的硅膠硅膠HF254：不含黏合劑，含有一種無機熒光劑（如錳激活的硅酸鋅），在254nm波長紫外光下呈強烈黃綠色熒光硅膠GF254：含有煅石膏黏合劑，含熒光劑，在254nm波長紫外光下呈強烈黃綠色熒光硅膠HF254+366：不含粘合劑，在254與366nm波長有熒光硅膠PF254：制備型的，在254n

5、m有熒光（有熒光劑，適用于不發(fā)光不易顯色物質(zhì)的制備與分離）,市售預(yù)制板規(guī)格,將吸附劑或載體均勻涂布在玻璃板、塑料片或鋁箔上的預(yù)制板。薄層有軟板及硬板兩種。硬板系在吸附劑中加入適量粘合劑后用濕法涂層，粘合劑的加入可以增加薄層的強度。常用的粘合劑為羧甲基纖維素鈉(CMCNa)或煅石膏(CaSO41/2H2O)使用前一般應(yīng)于110℃下活化30min薄層厚度約為 0.2-0.3mm。 制備板0.5-2mm。,薄層的制備,手動點

6、樣：靈活方便，常用于各種TLC鑒別中。自動點樣 重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性好，常用于薄層掃描法的含量測定。,半自動點樣儀,點樣量：原點位置的負荷有限，體積0.5～10微升，濃度通常為0.5～2mg。直徑3mm以內(nèi)樣品溶劑：原則上應(yīng)選擇對可以溶解但溶解度不是很大的溶劑一定要有交叉點,點樣,Spyringe,10,Note: a.點樣的濃度要控制適當(dāng)； b.點的斑點較小，展開的TLC 分離度

7、好 c. 0.3mm 毛細點有機相， 0.5mm點水相。,毛細管取樣1cm？ 3.14*（0.3mm/2）²*10mm=1.413mm³=0.71μL 3.14*（0.5mm/2）²*10mm=3.925mm³=1.96μL,點樣常見問題,1、點樣量太多。展開劑不能全部負載2、太濃了。展開劑從原點外圍繞行3、濃。未分開4、樣品溶劑殘留。吹干時應(yīng)注

8、意高溫 破壞樣品5、點樣量太少?？床磺?、樣品溶劑中溶解度很大。原點將變 成空心圓,12,Note: a.產(chǎn)品在水相 or有機相； b.有無沒溶解的固體。,反應(yīng)液的取樣：,展開方法 展開劑浸入薄層下端高度不應(yīng)超過 0.5cm，當(dāng)心將樣品帶被展開劑浸泡硬板可以進行近水平、上行、下行、雙向、多次展開等展開槽有直立式、平臥式、雙槽式、夾心式或水平式,Note：

9、a.展開槽應(yīng)密閉。溶劑蒸氣、液相( 展開劑)、固定相 ( 吸附劑) 一起構(gòu)成復(fù)雜的三維層析過程b.展缸預(yù)先飽和以減弱邊緣效應(yīng)，如果薄層板也同時預(yù)飽和效果更佳。c.點樣帶寬時（常見制備板）。先用大極性溶劑展2cm以濃集樣品，干燥薄層板，再用所需展開劑展開。,使各成分間有較好的分離;Rf在0.2～0.8為有效;監(jiān)控點應(yīng)在0.4~0.6之間不與待測組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng);沸點適中，黏度較?。徽归_后組分斑點圓且集中；混合溶劑最好新鮮

10、配制;,展開劑的選擇原則,16,展開方向有單向、單向長板、多次、多種極性展開等.,展一次,展多次,第一次展開PE/EA=4:1,第二次展開CH2Cl2/MeOH=10:1,采用多次展開的方法可以提高TLC的分離效果。做一次檢測得到較多的樣品信息，展開前多思考。,17,展開機理的探討,ABCD為硅膠層， EFCDG為展開劑，EF為展開劑前沿，CDG為展開劑水平面。展開劑以硅膠膠表面ED為界分,毛細層（EFCD）內(nèi)的展開劑理所當(dāng)然向A

11、B方向運動依附層（EDG）的展開劑作為額外的補充源泉 同一瞬間，跨過薄層板上任一點展開劑的絕對量彼此相等，但由于液層厚度不同，必然存在速度差異所以，Rf 值越大 ，斑點也就越大。,堿性物質(zhì)能與硅膠作用，易被吸附出現(xiàn)脫尾，加TEA，NH3H2O，Pyridine等避免,先低后高，先單一后復(fù)雜，酸加酸，堿加堿，羰基加丙酮，相似相容原則,展開劑的選擇方法,石油醚<二氯甲烷<乙醚<四氫呋喃<乙酸乙酯<丙

12、酮<正丙醇<甲醇<水,常用展開劑極性順序,三角形法,（a）適于吸附薄層; (b) 適于分配薄層.,（a）,苯,點滴實驗法,最合適的展開劑？,Note：a.展開劑渾濁不清，應(yīng)分液澄清后b.正丁醇和丙醇對斑點擴散影響較小c.丙酮可混溶溶劑，降低劑粘度，加快展速d.由于混溶性和硅膠耐酸能力的限制，水和酸的使 用是有限度的。,大展開劑: ArOH (aq sat.)、n-BuOH (aq

13、 sat.) 、nBuOH-AcOH-H2O(5:1:1)、iPrOH-NH4OH-H2O(10:5:1),常用展開劑對：E/P、M/D、PE / Acetone、THF/PE、 MeOH/Toluene、DCM/PE,nBuOH/acetone/AcOH/H2OVB1及其磷酸酯,nPrOH/NH3H2O(con.)/H2O=20/20/1AMP單磷酸及3,5-雙磷酸,n-BOH/HOAc/

14、H2O=5/1/1巰基乙胺及甲基化后,DCM/MeOH/HOAc=10/1/0.05甘氨膽酸,THF/PE=2/3ED-71中間體,AsMg、FPM中間體硫醚，亞砜、砜,,,24,顯色,一看、首先在日光下觀察，劃出有色物質(zhì)的斑點位置二照、在紫外燈下觀察有無暗斑或熒光斑點三碘、多數(shù)有機物吸附碘可逆的產(chǎn)生棕色或黃色斑點四顯、既無色又無紫外吸收的物質(zhì)，可以用顯色劑顯色,,,DIEA,PE/EA=1:2,N

15、Et3,25,各種常用顯色劑及其配制方法:,,26,續(xù)表,,定性,影響Rf值的因素較多：溫度、濕度。一般在較高溫度下展開時，Rf值較高，反之降低需經(jīng)過兩種以上不同組成的展開劑得到的 R f值與標(biāo)準(zhǔn)品一致時，才可認(rèn)定該斑點與標(biāo)準(zhǔn)品是同一化合物；通過斑點顏色，有無紫外吸收或產(chǎn)生螢光的顏色，以及用專屬性顯色劑后斑點顯色的情況與標(biāo)準(zhǔn)品對照可幫助鑒定,手性薄層色譜,一、手性選擇劑混合制板（較難實現(xiàn)）二、手性選擇劑添至流動相中，作展

16、開劑使用三、？,好的分析方法應(yīng)該是簡單的，簡潔是一種美。,手性薄層色譜分離的因素,手性選擇劑的種類、 純度、 濃度大小、 與吸附劑的比例,化合物消旋化， 配置成溶液后這種趨勢變得更大。,Nature 1965 208, p71 - 72,nBuOH/Pyridine/H2O=1/1/1L-isomerD-isomer,nBuOH/Pyridine/H2O=1/1/1L-isomerD-isomer,31,TLC用途,3

17、2,監(jiān)測反應(yīng)進程:,反應(yīng)有無新點產(chǎn)生原料有無剩余，剩余多少反應(yīng)是否干凈綜合判斷反應(yīng)如何處理,,Note：點樣量 b.檢測時間c.留樣對照 d. 重要板留存,33,反應(yīng)物加完應(yīng)立即檢測；反應(yīng)中出現(xiàn)變化（溫度，顏色，氣體、沉淀）立即檢測反應(yīng)物加完后半小時內(nèi)應(yīng)檢測，然后適時跟蹤檢測快速反應(yīng)的體系（如硝化、還原），在短時間內(nèi)需要檢測過夜反應(yīng)，過夜前后應(yīng)檢測,檢測時機,34,極性增大:NO2?

18、NH2RNH- Bn (Boc, Cbz) ? RNH2X ?-NH、CNR-S-R’ ? R-SO-R’CHO（ R-X ）?CH2OH ?CO2H,官能團轉(zhuǎn)化,極性相近的：R=R ??R-RCHO ??C=C,極性減小:OH?X (Cl, Br, I) COOH?CO2R ,R-SO-R’ ? R-SO2-R’-NH2(-OH) ? NH-R ,(OH- R ,),35,,TLC組合判斷,,TLC-HPLC/

19、LC-Ms聯(lián)用（定性和定量）TLC-MS聯(lián)用(適用于拿標(biāo)樣點）TLC-NMR聯(lián)用（確認(rèn)結(jié)構(gòu)）,,,,,,TLC,MS,,NMR,LCMs/HPLC,,36,后處理情況,,EA,,H2O,固體的純度和母液的取舍,,Solid,,Mother solution,萃取是否有效,37,摸索柱層析洗脫條件,Note: Rf值在0.2左右的展開劑比例為洗脫劑的合適值 過柱時組分流出順序未必和TLC上點極性順序一致,,,,,,

20、,Desired product,,梯度洗脫,39,制備TLC,展 開,刮板,洗 脫,點 板,,,,顯 色,,40,制備TLC,Note: 1 溶劑: 極性小, 溶解性好，易揮發(fā) 2 上樣量: 40-60mg 3 上樣的位置: 距離兩端大約1cm, 距離底邊大約2cm.,Note: 上樣時如果上的色帶太寬或不齊 可用大極性溶劑預(yù)展開 2~3 cm,4