環(huán)境污染控制過程高靈敏生物傳感技術(shù)研究及其檢測(cè)體系構(gòu)建.pdf

1、在環(huán)境污染控制過程中，污染物的降解大多是通過微生物的相互協(xié)同作用完成的，對(duì)污染物及參與降解過程的微生物的種群分布、功能活性和代謝產(chǎn)物變化等進(jìn)行快速、靈敏的追蹤、監(jiān)測(cè)與時(shí)空分辨，是研究污染物降解過程的重要途徑。生物傳感技術(shù)是一種對(duì)待測(cè)物實(shí)現(xiàn)快速、實(shí)時(shí)、在線分析檢測(cè)的新興技術(shù)，它利用生物識(shí)別作用對(duì)待測(cè)的物質(zhì)進(jìn)行分析測(cè)定，與傳統(tǒng)的分析方法相比，具有高靈敏度、高專一性、快速測(cè)定、簡(jiǎn)便易攜、適用于復(fù)雜體系的實(shí)時(shí)、在線測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，為環(huán)境污染物及其降

2、解過程涉及到的各種生物組分或代謝產(chǎn)物的分析檢測(cè)提供了一個(gè)新的技術(shù)平臺(tái)。 系統(tǒng)地構(gòu)建環(huán)境污染控制過程中生物傳感技術(shù)檢測(cè)體系，為環(huán)境污染控制工作提供及時(shí)、準(zhǔn)確的生物信息，對(duì)于解決環(huán)境科學(xué)與工程領(lǐng)域的實(shí)時(shí)、在線監(jiān)測(cè)技術(shù)難題，最終實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制，推動(dòng)環(huán)境檢測(cè)技術(shù)大跨度發(fā)展具有重要意義。 本文研制了一系列生物傳感檢測(cè)方法，用于環(huán)境中痕量污染物及其降解產(chǎn)物等的高靈敏檢測(cè)，并以堆肥環(huán)境體系為例，建立起了一套基于生物傳感技術(shù)的檢測(cè)環(huán)

3、境復(fù)雜系統(tǒng)中的污染物及參與其降解過程的生物酶、微生物種群、功能基因和代謝產(chǎn)物動(dòng)態(tài)變化的新方法體系，克服了傳統(tǒng)的分析檢測(cè)方法在環(huán)境污染控制過程實(shí)時(shí)在線檢測(cè)等方面的局限性，有利于深入了解整個(gè)垃圾堆肥處理過程的微生物學(xué)機(jī)理，高效指導(dǎo)微生物接種和堆肥工藝革新。 論文工作從整體上分為四個(gè)部分： 第一部分為環(huán)境中痕量有毒有害污染物及降解產(chǎn)物的高靈敏生物傳感檢測(cè)技術(shù)研究。通過采用二茂鐵摻雜電聚合和伴刀豆蛋白A自組裝等技術(shù)將酶固定在

4、電極表面，構(gòu)建了抑制型葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅骱鸵种菩屠备^氧化物酶?jìng)鞲衅鳎謩e用于檢測(cè)土壤樣品中的痕量Cr(Ⅵ)和Hg(Ⅱ)與湘江水中的苯肼，具有靈敏度高、抑制可逆、穩(wěn)定性和選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，獲得的Cr(Ⅵ)和Hg(Ⅱ)的檢測(cè)下限均為0.49μg L-1，苯肼的檢測(cè)下限為1.7×10-6 M，并運(yùn)用酶?jìng)鞲衅鲗?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，推導(dǎo)出了辣根過氧化物酶對(duì)H2O2、對(duì)苯二酚的催化反應(yīng)以及苯肼對(duì)該反應(yīng)的抑制作用的動(dòng)力學(xué)模型，進(jìn)行了模型擬合與參數(shù)估計(jì)；

5、 將有機(jī)氯農(nóng)藥毒莠定與牛血清蛋白交聯(lián)制備人工抗原，并注射入新西蘭大白兔體內(nèi)提純出抗體，研制了一種基于殼聚糖/納米金復(fù)合膜的電化學(xué)免疫傳感器，用于檢測(cè)稻米、萵苣和稻田水中的痕量毒莠定，該免疫膜具有很好的選擇性，靈敏度高，可批量制作、一次性使用，檢測(cè)下限為5 ng mL-1； 利用酚類物質(zhì)普遍具有的還原性，研制了一種傳感晶片，以固定在玻片表面的金納米顆粒為晶種，運(yùn)用在酚還原作用下金納米顆粒催化增長(zhǎng)的原理和吸收光譜變化規(guī)律，用于好氧

6、發(fā)酵液等復(fù)雜體系中酚濃度檢測(cè)，檢測(cè)下限為7×10-6M，該方法操作簡(jiǎn)便，成本低，靈敏度高；還利用漆酶催化鄰苯二酚氧化還原反應(yīng)和磁性顆粒分離技術(shù)，研制了一種基于磁性納米顆粒固定技術(shù)的漆酶?jìng)鞲衅鳎捎糜跈z測(cè)堆肥復(fù)雜系統(tǒng)中的濃度低至7.5×10-7M的痕量鄰苯二酚。 第二部分著重開展基于生物傳感技術(shù)的堆肥系統(tǒng)微生物降解酶活性及生物表面活性劑的跟蹤監(jiān)測(cè)。堆肥系統(tǒng)中多種酶的活性是檢測(cè)堆肥腐熟度的重要指標(biāo)，本文利用電極表面固定化納米金原位

7、擴(kuò)增對(duì)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化的生物電催化活性，研制了一種新型NADH電化學(xué)傳感器，響應(yīng)迅速，靈敏度高，能夠在酸性緩沖液中檢測(cè)濃度低至2.5×10-7M的NADH，3個(gè)月內(nèi)保持檢測(cè)結(jié)果精確；利用在NADH還原作用下Au/Ag核殼型納米顆粒催化增長(zhǎng)的原理和吸收光譜變化規(guī)律，研制了一種NADH光學(xué)納米生物傳感晶片，檢測(cè)下限為1.56×10-5M；利用木素過氧化物酶(LiP)和錳過氧化物酶(MnP)催化底物的氧化還原反應(yīng)，研

8、制了一種快速同步檢測(cè)堆肥中木質(zhì)素降解酶活的電化學(xué)酶?jìng)鞲衅?，檢測(cè)樣品LiP活性范圍為8.14～29.79 U L-1，MnP活性范圍為0.085～1.37 UL-1，該方法能夠排除堆肥浸出液中濁度和光干擾物質(zhì)的干擾，較傳統(tǒng)的分光光度法更加快速、靈敏和精確，是堆肥系統(tǒng)中快速、低成本的堆肥腐熟度檢測(cè)技術(shù)； 堆肥常見微生物銅綠假單胞菌發(fā)酵代謝產(chǎn)生的鼠李糖脂是一種可改善堆肥微環(huán)境的生物表面活性劑，本文制備了二鼠李糖脂人工抗原和抗體，研制

9、了一種基于3，3，-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色的二鼠李糖脂酶聯(lián)免疫試紙，可用于肉眼檢測(cè)濃度低至0.05 mg L-1的二鼠李糖脂，該方法簡(jiǎn)便、快速，可重復(fù)性良好。 第三部分著重開展基于基因傳感技術(shù)的堆肥系統(tǒng)微生物種群動(dòng)態(tài)和功能基因的跟蹤監(jiān)測(cè)。堆肥中某些高效降解污染物的微生物具有相應(yīng)的功能基因，LiP是真菌降解木質(zhì)素的一種關(guān)鍵酶，設(shè)計(jì)合成了黃孢原毛平格菌lip基因探針，研制了一種夾心式雜交識(shí)別lip基因的酶聯(lián)電流型DNA傳感器，

10、結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和限制性酶切技術(shù)，成功檢測(cè)了黃孢原毛平格菌的基因組DNA提取樣品中的lip基因，檢測(cè)下限為0.03 nM，該DNA傳感器能夠有效識(shí)別相同長(zhǎng)度的錯(cuò)配核酸鏈樣品； 纖維二糖水解酶(CBH)是纖維素降解的一種關(guān)鍵酶，設(shè)計(jì)合成了瑞氏木霉cbh2基因探針，運(yùn)用納米金原位擴(kuò)增技術(shù)制備了一種金/硅/鐵三層復(fù)合型核殼磁性納米顆粒，研制成競(jìng)爭(zhēng)式雜交識(shí)別cbh2基因的電化學(xué)納米DNA傳感器，檢測(cè)下限達(dá)到10-13M；還

11、將羧基化的多壁碳納米管-多聚(3，4-乙烯二氧噻吩)復(fù)合膜沉積在電極表面，制備了cbh2基因傳感器，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，進(jìn)行了掃描電鏡(SEM)和電化學(xué)表征；細(xì)菌的16S rDNA/rRNA基因序列具有高度的保守性，可用于種屬特異性鑒定，研制了一種基于分子信標(biāo)熒光分析的銅綠假單胞菌16S rRNA體外定量檢測(cè)方法，用于檢測(cè)總RNA提取樣品中的16S rRNA，雜交反應(yīng)需時(shí)約30 min，該方法具有高度的特異性，不受核酸交叉污染，檢測(cè)前不需要對(duì)

12、細(xì)菌總RNA進(jìn)行分離和純化。 第四部分為復(fù)雜環(huán)境體系污染物及降解性能定量檢測(cè)的數(shù)據(jù)解析。由于環(huán)境樣品組成復(fù)雜，干擾物質(zhì)較多，多種待測(cè)組分可能同時(shí)存在，給分析監(jiān)測(cè)帶來很大的不確定性，本文利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANNs)解析信號(hào)的優(yōu)良性能，將人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和電化學(xué)酶?jìng)鞲屑夹g(shù)相結(jié)合，用于黃孢原毛平革菌接種堆肥中木質(zhì)素降解酶活性電化學(xué)檢測(cè)及漆酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)鄰苯二酚的定量分析，與線性回歸模型相比，該方法更加精確、靈敏、穩(wěn)?。?土壤陽離