內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬在成骨不全膠原蛋白形成中的作用.pdf

1、成骨不全（osteogenesis imperfecta, OI），又稱脆骨病，是一種結(jié)締組織異?？蛇z傳疾病，臨床表現(xiàn)包括：多發(fā)性骨折及長期骨折引起的骨骼畸形，脊柱側(cè)彎，牙本質(zhì)發(fā)育不全，藍(lán)鞏膜，皮膚彈性下降和關(guān)節(jié)松弛等。成骨不全是遺傳性罕見疾病，兒童中的發(fā)病率不到萬分之一，約90％的患者因?yàn)镃OL1A1和COL1A2基因突變，導(dǎo)致膠原蛋白合成數(shù)量及結(jié)構(gòu)異常引起。突變蛋白堆積在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通

2、過細(xì)胞自噬（Autophogy）對異常的膠原分子和前膠原蛋白進(jìn)行降解，同時通過多種途徑促進(jìn)正常膠原蛋白的產(chǎn)生。
　　研究目的：
　　1)驗(yàn)證成骨不全患者原代細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞自噬的存在。
　　2)初步探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞自噬對膠原蛋白合成的影響，為該病的治療尋找新思路。
　　研究方法：
　　1)采集成骨不全患者和正常人骨、皮膚組織樣本和臨床信息。
　　2)成骨/成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)并提取細(xì)胞RNA和

3、全蛋白
　　3)通過RT-qPCR，在基因水平進(jìn)行內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞自噬的驗(yàn)證。
　　4)通過免疫印記方法，在蛋白水平進(jìn)行內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞自噬的驗(yàn)證
　　5)通過透射電鏡（50萬倍）觀察，應(yīng)激細(xì)胞自噬過程的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。
　　6)探索優(yōu)化膠原蛋白的提取方法。
　　7)利用氯喹等試劑，探索細(xì)胞自噬的信號通路。
　　8)通過對膠原蛋白合成量的分析，判斷抑制劑和激動劑對信號通路的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

4、r>　　1)組織處理及成纖維細(xì)胞培養(yǎng)
　　成骨不全患者的皮膚和骨組織經(jīng)處理后于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，在含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，24h內(nèi)開始貼壁，貼壁效果良好。
　　2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激驗(yàn)證試驗(yàn)
　　與對照組相比，成骨不全患者原代成纖維細(xì)胞中提取的核酸分析結(jié)果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因Bip上調(diào)1.5-2.5倍，GRP94上調(diào)2.1-3.3倍， ERp72上調(diào)1.38-2.4倍， Hsp47上調(diào)1

5、.6-2.7倍。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白，Hsp47實(shí)驗(yàn)組條帶明顯，對照組無明顯條帶；Bip、Grp94、Erp72實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)量分別是對照組7.56倍、7.34倍和3.54倍。
　　3)細(xì)胞自噬驗(yàn)證試驗(yàn)
　　與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞自噬相關(guān)基因p62上調(diào)2.2-2.4倍，LC3上調(diào)1.7-3.2倍。利用免疫酶標(biāo)技術(shù)分析蛋白表達(dá)量差異，結(jié)果顯示，對照組只表達(dá) LC3I型蛋白，實(shí)驗(yàn)組同時表達(dá)LC3I型和LC3II型蛋白，表達(dá)量是對

6、照組3.08倍。
　　4)自噬小泡觀察
　　透射電鏡觀察結(jié)果，成骨不全患者原代體細(xì)胞中出現(xiàn)了自噬小泡。
　　5)膠原蛋白提取方法的探索
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明從細(xì)胞中和培養(yǎng)液中提取的膠原蛋白，最適的胃蛋白酶消化時間為5小時,作用濃度1mg/mL。培養(yǎng)液中抗壞血酸濃度在0.1~0.15mM之間，β-氨基丙腈濃度達(dá)到0.1mM時，連續(xù)培養(yǎng)96h以上膠原蛋提取量最理想。
　　6)自噬抑制劑和激活劑對成骨不全成纖維細(xì)胞生

7、長影響
　　初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成骨不全成纖維細(xì)胞自噬通路部分抑制后，有利于細(xì)胞的存活，自噬加強(qiáng)后細(xì)胞快速死亡。
　　7)細(xì)胞自噬對膠原蛋白合成的影響
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在成骨不全患者體細(xì)胞中，自噬激動劑明顯抑制膠原蛋白的合成，自噬抑制劑可以提高膠原蛋白亞基和成熟膠原的合成。
　　結(jié)論：
　　通過一系列的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，成骨不全患者的成纖維細(xì)胞中存在明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激現(xiàn)象，與膠原蛋白修飾折疊相關(guān)的分子伴侶表達(dá)量明顯提高，