自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在大鼠腦缺血預(yù)適應(yīng)中的作用和藥物干預(yù).pdf

1、目的：觀察大鼠腦缺血預(yù)適應(yīng)中自噬的激活，探討自噬激活在腦缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)中的作用，以及腦缺血預(yù)適應(yīng)模型中自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、熱休克蛋白HSP70之間的內(nèi)在聯(lián)系，探索自噬誘導(dǎo)劑能否模擬缺血預(yù)適應(yīng)的生物效應(yīng)用于防治缺血性腦中風(fēng)引起的神經(jīng)損傷。 方法：本實(shí)驗(yàn)中采用兩次插入線栓的方法制備局灶性腦缺血預(yù)適應(yīng)模型；首次預(yù)缺血(IPC)時(shí)間為10 min，預(yù)缺血10 min后拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌，24 h后行再次插入線栓永久性阻塞大腦中動(dòng)脈

2、(PFI)，自噬抑制劑3-methyladenin(3-MA)、自噬激活劑rapamycin(雷帕霉素)側(cè)腦室注射給藥，通過神經(jīng)癥狀評(píng)分、腦梗塞體積、腦含水量測(cè)定以及腦組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)腦損傷程度。用電鏡觀察大鼠腦缺血預(yù)適應(yīng)模型中自噬激活和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況，采用Western blot法檢測(cè)大鼠腦缺血預(yù)適應(yīng)模型中自噬相關(guān)蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白及熱休克蛋白HSP70的表達(dá)。 結(jié)果：電鏡觀察顯示，IPC6h和24h皮層神經(jīng)元胞漿內(nèi)均有雙

3、層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體出現(xiàn)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激表現(xiàn)。PH組6h神經(jīng)元內(nèi)也有自噬小體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激表現(xiàn)，而在PFI組24h，神經(jīng)元出現(xiàn)為凋亡或壞死的形態(tài)特征。IPC+PFI組與PFI組相比較，神經(jīng)元核膜比較完整，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)相對(duì)正常，在6 h和24 h胞漿內(nèi)均出現(xiàn)自噬小體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)張，腔內(nèi)出現(xiàn)灰白色聚集物。IPC+PFI可顯著改善大鼠的神經(jīng)行為學(xué)障礙，減小腦梗塞體積，減輕腦水腫(與PFI相比，P<0.01)，提示缺血預(yù)適應(yīng)可誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用。但3-MA

4、(200和400 nmol)，則顯著加重缺血大鼠的行為學(xué)障礙，使腦梗塞體積增大，腦水腫嚴(yán)重(與溶劑+IPC+PFI組相比，P<0.01)，提示自噬抑制劑取消了缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。Western blot結(jié)果顯示，缺血后6 h， IPC，PFI，IPC+PFI以及溶劑+IPC+PFI組，LC3和Beclin1的表達(dá)均上調(diào)(與假手術(shù)組相比，P<0.01)，各組間無顯著差異，但缺血24 h，僅IPC，IPC+PFI組LC3、Becl

5、in1表達(dá)上調(diào)(與假手術(shù)組相比，P<0.01)，且IPC+PFI組較PFI LC3、Beclin1上調(diào)組更為顯著(P<0.01)；3-MA不論在6 h還是24 h都明顯抑制LC3、Beclin1的表達(dá)(與溶劑+IPC+PFI組相比，P<0.01)。缺血24 h，IPC，PFI組HSP70均顯著上調(diào)(與假手術(shù)組相比，P<0.01)，IPC+PFI以及溶劑+IPC+PFI組HSP70表達(dá)則更加增強(qiáng)(與PFI組相比，P<0.01)，但3-MA

6、則明顯抑制HSP70的表達(dá)(與溶劑+IPC+PFI組相比，P<0.01)。缺血后24 h，caspase-12在PFI組表達(dá)顯著升高(與假手術(shù)組相比，P<0.01)，但I(xiàn)PC+PFI組caspase-12表達(dá)下降(與PFI組相比，P<0.01)，3-MA則增加caspase-12的表達(dá)(與溶劑+IPC+PFI組相比，P<0.01)。提示3-MA阻斷缺血預(yù)適應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)作用與抑制自噬有關(guān)。自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(8、16和32 ng)在PFI

7、24 h前給藥，與單純?nèi)毖M相比較，能顯著改善大鼠的神經(jīng)行為學(xué)障礙，減小腦梗塞的面積，減輕腦水腫(與PFI組相比，P<0.01)，提示預(yù)先激活自噬能產(chǎn)生對(duì)缺血的耐受。 結(jié)論：1.腦缺血預(yù)適應(yīng)能誘導(dǎo)自噬激活和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。2.自噬抑制劑3-MA能阻斷腦缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用，可能是通過抑制LC3、Beclin1的表達(dá)，即通過抑制自噬-溶酶體途徑實(shí)現(xiàn)的。3.缺血預(yù)適應(yīng)能誘導(dǎo)適宜的ER應(yīng)激，上調(diào)HSP70，下調(diào)caspase-12