圣湘生物pcr新技術(shù)簡介迪安培訓(xùn)

1、,高精度PCR檢測肝病毒的現(xiàn)狀及進(jìn)展湖南圣湘生物科技有限公司 唐國政,,,,,,HBV慢性攜帶者（3.5億慢性攜帶者）（分布）百分率,< 2% 低分布區(qū),2-7% 中度分布區(qū),> 8% 高度分布區(qū),乙肝病毒感染呈全球性分布,中國是乙肝“大國”,乙肝是我國一個威脅健康的嚴(yán)重問題,每年有35萬人死于乙肝病毒引起的肝臟疾病其中18萬人死于乙肝病毒引起的肝癌,1.2億乙肝病毒攜帶者,3000萬慢性乙肝患者,“十一五”重大傳染病

2、專項計劃病毒性肝炎重大研究專項啟動,2009年，我國病毒性肝炎領(lǐng)域最重要的進(jìn)展是國家“十一五”重大傳染病專項計劃“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項啟動（見表1）。這是“十一五”期間與“載人航天與探月工程、大型飛機”等相平行的16個重大專項計劃之一。,表1 、國家中長期科技發(fā)展規(guī)劃綱要（2006~2020年）確定的重大科技專項,,,HBV 復(fù)制周期(Replication cycle of HBV),慢性乙肝的本質(zhì)是由病

3、毒引發(fā)的免疫清除給肝細(xì)胞帶來的損傷,,,,,免疫系統(tǒng),,主 題,肝病毒PCR檢測的臨床需求及現(xiàn)狀高精度肝病毒PCR檢測技術(shù)介紹,血清HBV DNA水平是臨床上評價HBV復(fù)制情況的“金標(biāo)準(zhǔn)”,Lok AS, et al. Hepatology. 2009;50:661-662Liaw YF, Liver International, 2009,29(s1):100-1-7,慢性乙肝病毒感染的自然史,,急性HBV感染,慢性攜帶者,

4、康復(fù),,,30~50 年,慢性乙肝,穩(wěn)定,進(jìn)展,肝硬化,代償性肝硬化,,肝癌,死亡,,,失代償肝硬化(死亡）,,,,,,HBV DNA高載量是肝硬化發(fā)生的重要相關(guān)因素,§ N=3,774; p value for log-rank test, <0.001,Chen CJ et al JAMA 2006;295:65Iloeje U et al Gastroenterology 2006,130:678-686,,全

5、球權(quán)威指南一致認(rèn)為：乙肝治療的根本目的在于長期持續(xù)抑制病毒復(fù)制，阻止疾病進(jìn)展,“持續(xù)抑制病毒復(fù)制，減輕肝臟炎癥、壞死，從而延緩和阻斷肝硬化和肝癌的發(fā)生”,抗病毒治療為什么需要長期？,病毒很難除“根”—cccDNA,抗病毒治療只是抑制病毒復(fù)制,停藥后，病毒“復(fù)活”，導(dǎo)致疾病反復(fù)、進(jìn)展,需要長期抗病毒治療,,,,,長期抗病毒治療帶來的益處,,抑制乙肝病毒復(fù)制，延緩疾病進(jìn)展,提高生活質(zhì)量，延長存活時間,調(diào)節(jié)乙肝患者的精神狀態(tài)，減輕心理壓力,減

6、輕家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和家庭成員的負(fù)擔(dān),目前常用的抗病毒藥物:,干擾素普通干擾素聚乙二醇干擾素α-2a(PEG-IFNα-2a)核苷(酸)類似物拉米夫定阿德福韋酯恩替卡韋替比夫定等,干擾素治療有哪些優(yōu)點和缺點？,干擾素是通過調(diào)節(jié)機體免疫力達(dá)到治療目的優(yōu)點：療程固定缺點：為注射制劑，使用不方便降病毒能力不強副作用較大禁忌癥較多耐受率低,EASL Clinical Practice GuidelinesJournal

7、 of Hepatology 50 (2009) 227–242,核苷類藥物治療有哪些優(yōu)點和缺點？,核苷類藥物直接抑制病毒復(fù)制優(yōu)點：降病毒快速、強效為口服制劑，使用方便不良反應(yīng)少缺點：有耐藥性療程不確定,EASL Clinical Practice GuidelinesJournal of Hepatology 50 (2009) 227–242,現(xiàn)有的抗病毒藥物,?-干擾素拉米夫定阿德福韋酯、聚乙二醇干擾素等,80

8、年代,90年代后期,2005年后,反應(yīng)乙肝病毒載量金標(biāo)準(zhǔn)：乙肝病毒DNA檢測,HBV DNA：乙肝病毒脫氧核糖核酸，可直接了解體內(nèi)病毒載量和復(fù)制情況；并可用于判斷抗病毒治療的效果。,2012：HBV DNA detection and HBV DNA level measurement are essential for the diagnosis, decision to treat and subsequent monitor

9、ing of patients (A1). Follow-up using realtime PCR quantification assays is strongly recommended because of their sensitivity, specificity, accuracy and broad dynamic range [38–41] (A1).,2009： Recently, HBV DNA assays t

10、hat utilize real-time PCR technology with improved sensitivity(5-10 IU/mL) and wider dynamic range (up to 8-9 log10 IU/mL) have become available,乙肝治療指南：美國和歐洲,Hepatology, 2009J Hepatol, 2012,HBV DNA載量PCR檢測的國際指南,誰需要檢測：HB

11、sAg陽性患者和HBsAg陰性的高危人群攜帶者、慢乙肝患者、肝硬化和肝癌患者什么時候檢測：未治療患者、治療前、治療中、結(jié)束治療后均需檢測,HBV DNA載量檢測在治療優(yōu)化路線圖中的作用,HBV DNA載量檢測在治療優(yōu)化路線圖中的作用,抗病毒治療前病毒基線的準(zhǔn)確測定：—適宜抗病毒治療患者選擇、抗病毒治療方案的確定、抗病毒療效的預(yù)測與后續(xù)療效比對抗病毒治療過程中療效的評估和方案優(yōu)化、耐藥突變檢測和治療終點的確認(rèn)抗病毒優(yōu)化治療停藥

12、后隨訪及復(fù)發(fā)再治的判斷隱匿性病毒性肝炎的診斷,高精度核酸定量檢測是保證乙肝患者走好抗病毒優(yōu)化治療之路的導(dǎo)航系統(tǒng),HBV DNA定量PCR檢測的國際指南要求,超敏感（Hypersensitivity）—HBV最低檢測限＜10-15 IU/ml寬線性范圍（ wider dynamic range ）—涵蓋101~109 IU/ml高特異性（ High specificity）可重復(fù)性好（ Repeatability）—（操作

13、簡單，或可自動化）,HBV DNA 檢測臨床應(yīng)用發(fā)展,,進(jìn)口HBV DNA PCR試劑性能的比較,,我國某些RT-PCR乙肝試劑盒的靈敏度及線性范圍現(xiàn)狀：,,國產(chǎn)HBV DNA PCR試劑性能現(xiàn)狀,現(xiàn)有的國產(chǎn)試劑在檢測靈敏度、線性范圍、可重復(fù)性等方面無法滿足臨床上日益增加的對HBV DNA定量準(zhǔn)確性和靈敏度的要求部分試劑缺乏內(nèi)標(biāo)，影響定量準(zhǔn)確性,中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012,(無天、無地、無標(biāo)、無法),HBV DNA定量使用低精度試劑

14、的后果,臨床實踐中影響臨床療效的準(zhǔn)確評估，從而使病人療效出現(xiàn)偏差臨床研究中弱化抗病毒療效,主 題,肝病毒PCR檢測的臨床需求及現(xiàn)狀超敏感肝病毒PCR檢測技術(shù)介紹,磁珠法——在樣本中加入超順納米磁珠，富集微量的病毒核酸分子，然后再擴增…,動畫演示,乙肝病毒核酸提取不同技術(shù)比較,磁珠法的性能之一,靈敏度達(dá)到 10 IU/ML低濃度樣本（10 IU/ml）的靈敏度檢測結(jié)果圖（重復(fù)90次，檢出率為100%）,,線性范圍寬： 2

15、0 IU/ml～2.00E+09 IU/ml,磁珠法的性能之二,,重復(fù)性好，精密度高批內(nèi)(重復(fù)10次測試) 、批間(重復(fù)30次測試)Ct值變異系數(shù)（CV）均<2%；濃度值對數(shù)值變異系數(shù)（CV） <8%,磁珠法的性能之三,,抗干擾能力強，在高血脂、溶血、黃疸及藥物治療后等異常樣本時，提高了檢測的可靠性,磁珠法的性能之四,,操作簡單，過程溫和，提取快速。與其它方法相比，無需加熱、無需高速離心、無需分離上清液或磁珠顆粒,磁珠法的

16、性能之五,,圣湘高精度HBV DNA試劑性能多中心評測,研究單位 負(fù)責(zé)人 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 譚德明 中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院 竇曉光 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 陳金軍,初步報告，2012,研究方法,502份慢性乙型肝炎患者的血漿或血清樣本(來自于三所醫(yī)院的門診和住院病人)，采集的標(biāo)本-20℃～-80℃低溫冰箱保存，同時用Roche

17、COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan（CAP/CTM）HBV診斷試劑和湖南圣湘生物科技有限公司的磁珠法HBV DNA定量試劑進(jìn)行檢測。,,圣湘磁珠法HBV DNA試劑與羅氏試劑比較研究結(jié)果,圣湘磁珠法HBV DNA試劑與羅氏試劑比較研究結(jié)果,羅氏試劑盒與圣湘磁珠法試劑盒檢測結(jié)果比較統(tǒng)計表 羅氏試劑盒與圣湘磁珠法試劑盒檢測結(jié)果的一致性分析：陽性一致性百分比=468/472×100%＝

18、99.2%陰性一致性百分比= 94/153×100%＝61.4%總一致性百分比=（468+94）/635×100%＝88.5%,磁珠法HBV DNA檢測試劑與羅氏試劑比較研究結(jié)果,,羅氏試劑盒與圣湘磁珠法試劑盒檢測均有定量結(jié)果的樣本共407例 兩種試劑定量差異: 羅氏：7份； 羅氏>圣湘：14份,兩種試劑定量檢測結(jié)果的散點圖,兩種試劑檢測結(jié)果的擬合優(yōu)度情況（相關(guān)分析）,（回

19、歸分析）常數(shù)項和系數(shù)的檢驗結(jié)果,對檢測均為陽性的樣本，圣湘磁珠法試劑與羅氏試劑的定量檢測結(jié)果具有線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R=0.966；回歸方程為：y=0.134+1.005x。,磁珠法HBV DNA檢測試劑與羅氏試劑比較研究結(jié)果,圣湘磁珠法與其它磁珠法病毒核酸提取差異,圣湘生物磁珠法肝病毒試劑盒的性能,國內(nèi)市場,北京佑安醫(yī)院北京首鋼醫(yī)院鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省傳染病醫(yī)院石家莊傳染病醫(yī)院蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)

20、院長征醫(yī)院上海長海醫(yī)院陜西省人民醫(yī)院山西省人民醫(yī)院,佑安醫(yī)院,鄭大一附院,陜西省人民醫(yī)院,國內(nèi)市場,武漢協(xié)和醫(yī)院湘雅一、二、三附屬醫(yī)院廣東省第二人民醫(yī)院湖南省人民醫(yī)院湖南省腫瘤醫(yī)院郴州市第一人民醫(yī)院福建醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院重慶大坪醫(yī)院……超過300家三級醫(yī)院,湘雅醫(yī)院,武漢協(xié)和醫(yī)院,廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心,,社會價值,2012年6月25日，《人民日報》頭版頭條新聞：從“雜交水稻之父”袁隆平到以“高性能炭/炭復(fù)合材料

21、”拿下空缺6年的國家技術(shù)發(fā)明一等獎的黃伯云，以及榮獲美國“國家科技獎?wù)隆?、擁?6項自主創(chuàng)新專利的戴立忠，一批科技領(lǐng)軍人物在湖南涌現(xiàn)，一批后起之秀在湖南集聚。,核心技術(shù)領(lǐng)軍人物-戴立忠 博士,2010年，中組部部長李源潮關(guān)心公司發(fā)展,改變，從現(xiàn)在開始,解讀基因，擴增健康,,標(biāo)本類型,血清（2-3ML）最好是使用EDTA抗凝全血標(biāo)本，抗凝后6h內(nèi)分離血漿。如使用血清標(biāo)本，則需盡快（2h內(nèi)）分離血清不能用肝素、枸櫞酸鈉、草酸鉀等抗凝劑,