漆酶在染料脫色和疏水性芳香化合物降解轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用研究.pdf

1、環(huán)境問(wèn)題是人類(lèi)21世紀(jì)所面臨的幾個(gè)重大問(wèn)題之一，環(huán)境保護(hù)也因此成為許多科技工作者競(jìng)相研究的課題。隨著生物科學(xué)和生物工程的迅速發(fā)展，生物技術(shù)在環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域逐漸展示了巨大威力，酶在環(huán)境保護(hù)方面的應(yīng)用已呈現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，它能夠催化大量的酚類(lèi)和芳香胺類(lèi)化合物的氧化，在小分子介體存在下，其氧化底物的范圍還可進(jìn)一步擴(kuò)大。由于漆酶作用底物廣，因此它在廢水處理、生物漂白、芳香化合物轉(zhuǎn)化、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2、
　　 漆酶的酶學(xué)性質(zhì)與其來(lái)源有關(guān)，本文研究了Irpex lacteus dft-1漆酶催化染料脫色反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，考察了反應(yīng)介質(zhì)條件和添加劑對(duì)脫色效果的影響，并利用響應(yīng)面法研究了Irpex lacteus dft-1漆酶催化染料RB亮藍(lán)(RBBR)脫色過(guò)程中多參數(shù)之間的交互作用。本文還考察了不同類(lèi)型表面活性劑(陽(yáng)離子型、陰離子型和非離子型)和聚乙二醇(PEG)對(duì)漆酶酶學(xué)性質(zhì)影響以及非離子表面活性劑Triton X-100對(duì)漆酶催

3、化轉(zhuǎn)化疏水性芳香化合物雙酚A(BPA)的影響及機(jī)制，研究了不同類(lèi)型表面活性劑組成的反膠束體系中漆酶的催化性能，探討了PEG400對(duì)AOT/異辛烷/水反膠束中漆酶催化BPA降解轉(zhuǎn)化的影響及其相應(yīng)機(jī)制，為進(jìn)一步研究漆酶在反膠束中催化轉(zhuǎn)化芳香化合物提供了理論基礎(chǔ)。
　　 一、Irpex lacteus dft-1漆酶催化染料廢水脫色
　　 來(lái)源不同的漆酶對(duì)染料廢水降解和脫色的能力不同，其最佳反應(yīng)條件也不同。由于介體價(jià)格較貴，因

4、此尋求無(wú)介體的漆酶催化染料脫色體系可以有效地降低染料廢水的處理成本。Irpex lacteus dft-1漆酶是一種新型漆酶。本文選用了三種不同類(lèi)型的染料，研究了在不加介體的情況下Irpex lacteus dft-1漆酶催化染料脫色反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，考察了反應(yīng)介質(zhì)條件和添加劑(非離子表面活性劑)對(duì)脫色效果的影響。研究表明，Irpex lacteus dft-1漆酶可以在不加介體的情況下對(duì)蒽醌染料茜素紅、偶氮染料甲基紅和三芳基甲烷染料溴甲酚

5、綠較好地脫色。染料結(jié)構(gòu)不同，脫色效果不同，而且最佳脫色pH也不同。當(dāng)加入Triton X-100和Brii30后，由于低濃度下它們對(duì)漆酶有激活作用和穩(wěn)定化作用，染料脫色率有所提高。
　　 響應(yīng)面方法(RSM)運(yùn)用了數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，可以用來(lái)建立模型、分析多變量間的交互影響作用，目前已經(jīng)被應(yīng)用于許多化學(xué)和生化過(guò)程的最佳化和評(píng)估獨(dú)立變量間的交互影響。本文通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)研究了Irpex lacteus dft-1漆酶催

6、化染料RB亮藍(lán)(RBBR)脫色反應(yīng)中不同參數(shù)(溫度、pH、酶濃度和反應(yīng)時(shí)間)之間的交互作用，得到了漆酶催化染料RBBR脫色的二次模型。高F值(2279.28)和低P值(＜0.0001)表明該模型是顯著的。結(jié)果表明，酶濃度是影響染料脫色過(guò)程的關(guān)鍵因素，pH與溫度的交互作用最為顯著。參數(shù)與響應(yīng)間的高R2值(0.9996)表明響應(yīng)面二次模型在本研究中較為適用。
　　 二、添加劑對(duì)水溶液中漆酶催化性能的影響研究
　　 在不同類(lèi)型

7、的表面活性劑組成的反膠束體系中，酶表現(xiàn)出的催化性能不同。這與反膠束體系的界面性質(zhì)有關(guān)。聚乙二醇(PEG)是一種合成聚合物，能夠溶解于水中，在漆酶轉(zhuǎn)化酚類(lèi)污染物時(shí)，能夠明顯提高酚類(lèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率。為了闡明不同反膠束中漆酶催化性能的差異和PEG對(duì)漆酶催化性能的影響，我們選定了三種不同的表面活性劑(陽(yáng)離子CTAB，陰離子AOT和非離子Triton X-100)和PEG，考察了其對(duì)漆酶酶學(xué)性質(zhì)的影響。研究表明，它們?cè)诓煌瑵舛认聦?duì)漆酶活性的影響不同

8、。PEG對(duì)漆酶活性沒(méi)有影響。非離子表面活性劑Triton X-100在低濃度下對(duì)漆酶略有激活作用，而陽(yáng)離子表面活性劑CTAB和陰離子表面活性劑AOT均抑制漆酶活性。當(dāng)表面活性劑濃度較高時(shí)，三種表面活性劑均使酶活性降低。PEG對(duì)漆酶的最佳反應(yīng)pH沒(méi)有影響。CTAB和AOT使漆酶的最佳pH略向低pH值方向移動(dòng)，而Triton X-100則使其向高pH值方向移動(dòng)。Triton X-100和PEG沒(méi)有引起漆酶最佳反應(yīng)溫度的變化，而加入CTAB和

9、AOT后，最佳反應(yīng)溫度值降低。在水溶液中加入Triton X-100和PEG有利于漆酶的熱穩(wěn)定性提高，而CTAB和AOT使漆酶熱穩(wěn)定性降低。
　　 在非離子表面活性劑TritonX-100存在下，漆酶催化疏水性芳香化合物雙酚A(BPA)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的研究表明，TritonX-100可以明顯提高BPA的轉(zhuǎn)化率，特別是在TritonX-100的臨界膠束濃度(CMC)附近。研究還發(fā)現(xiàn)，TritonX-100的存在可以提高反應(yīng)體系中漆酶的穩(wěn)

10、定性。熒光發(fā)射光譜研究表明，漆酶與TritonX-100間存在著相互作用，且這種相互作用有利于漆酶的折疊并使之穩(wěn)定化。束縛在漆酶表面的TritonX-100避免了反應(yīng)過(guò)程中生成的中間體自由基和聚合產(chǎn)物對(duì)漆酶的失活作用。通過(guò)研究不同酶濃度和不同底物濃度下BPA的轉(zhuǎn)化，我們發(fā)現(xiàn)若要達(dá)到相同的轉(zhuǎn)化率，加入TritonX-100后可以明顯降低漆酶的使用量。
　　 三、Irpex lacteus dft-1漆酶在反膠束中的催化性能研究

11、r>　　 對(duì)酶工程而言，除了要求酶活性較高外，還要求酶在反應(yīng)體系中有較高的穩(wěn)定性。有關(guān)漆酶在反膠束體系中穩(wěn)定性的研究似乎較少，特別是關(guān)于各影響因素對(duì)其穩(wěn)定性的影響還未有報(bào)道。本文重點(diǎn)考察了不同參數(shù)，即W0、緩沖液的種類(lèi)、pH和離子強(qiáng)度、AOT濃度和溫度等對(duì)Irpex lacteus dft-1漆酶在AOT/異辛烷/水反膠束中的活性和穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，Irpex lacteus dft-1漆酶活性隨W0的增大而提高。當(dāng)W0大于35

12、時(shí)，其活性不再有明顯的變化，而其穩(wěn)定性在較小的W0下較好。酶的最佳反應(yīng)pH為4.2，但其穩(wěn)定性隨pH的升高而增強(qiáng)。酶的活性和穩(wěn)定性均隨AOT濃度的提高而下降。不同的緩沖介質(zhì)，酶的活性與穩(wěn)定性不同，酶活性隨緩沖液離子強(qiáng)度的提高先升高而后下降，而酶在較小的離子強(qiáng)度下具有較好的穩(wěn)定性。酶最佳反應(yīng)溫度為50℃，但穩(wěn)定性隨溫度升高而下降。
　　 Irpex lacteus dft-1漆酶在CTAB/正己醇/異辛烷/水反膠束和Triton

13、X-100/正己醇/異辛烷/水反膠束體系中的活性明顯低于AOT/異辛烷/水反膠束中的活性，且三種反膠束體系中漆酶的活性隨W0的變化趨勢(shì)不同。另外，在CTAB和TritonX-100反膠束中漆酶的最佳反應(yīng)pH和溫度均分別為4.2和50℃，這與AOT反膠束體系中一致。另外，漆酶活性和穩(wěn)定性均隨表面活性劑濃度的提高而下降。助劑正己醇在較低濃度下對(duì)酶活性影響不大，但隨著正己醇的濃度繼續(xù)提高，酶活性明顯下降。總體來(lái)說(shuō)，酶的穩(wěn)定性在CTAB反膠束中

14、最佳，Triton X-100次之，而在AOT反膠束體系中酶活性在初始階段下降最快。
　　 Irpex lacteus dft-1漆酶在AOT/異辛烷/水反膠束內(nèi)可以有效地催化轉(zhuǎn)化BPA，加入適量PEG400后能明顯提高BPA的轉(zhuǎn)化速率。通過(guò)考察W0、緩沖液pH和離子強(qiáng)度以及表面活性劑AOT濃度等多個(gè)參數(shù)對(duì)BPA的轉(zhuǎn)化速率的影響，發(fā)現(xiàn)加入PEG400后，BPA在AOT/異辛烷/水反膠束體系中的轉(zhuǎn)化速率得到了提高。PEG400是水