2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、第一節(jié)間接法測(cè)抗體1.基本原理將特異性抗原包被在固相載體上,形成固相抗原,加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗體),其中抗體與固相抗原形成抗原抗體復(fù)合物,再加入酶標(biāo)記的抗抗體(抗人免疫球蛋白抗體,亦稱二抗),與上述抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。此時(shí)加入底物,復(fù)合物上的酶則催化底物而顯色。2.試劑與設(shè)備z純化抗原。z酶標(biāo)抗體(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人免疫球蛋白)z底物(鄰苯二胺OPD或四甲聯(lián)苯胺TMB)z底物緩沖液(Na2HPO40.184g構(gòu)椽酸0.047gH2

2、O10mlH2O25ul)zPBS(見(jiàn)附錄)zpH9.6碳酸鹽緩沖液CBS(見(jiàn)附錄)z洗液(PBS0.05%體積的Tween20)z稀釋液(100mlPBS1g牛血清血蛋白)z終止液(2molLH2SO4)z酶標(biāo)板(聚苯乙烯板)z微量加樣器z吸水紙z封口膠帶z酶標(biāo)儀z洗板機(jī)等。3.實(shí)驗(yàn)步驟一予試驗(yàn)(一)抗原包被的酶標(biāo)板的制備1.以碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋成適當(dāng)濃度(參考:5ugml),加入酶標(biāo)板(50ul孔),以膠帶封口,于4℃過(guò)夜。2.

3、棄抗原液,以雙蒸水沖洗3次,自然干燥后以膠帶封口。此為已知抗原包被的酶標(biāo)板,備用。(二)底物濃度的摸索在底物緩沖液中加入不同量的底物(參考:5mg10ml),加入酶標(biāo)板中(50ul孔),以膠帶封口,37℃避光保存2h,在沒(méi)有明顯變色的條件下選擇盡可能大的底物濃度。(三)酶標(biāo)抗體濃度的摸索1用稀釋液稀釋酶標(biāo)抗體至適當(dāng)倍數(shù)(參考:40~4000倍),加入已包被抗原的酶標(biāo)板中(50ul孔),封口后于37℃作用30min。以洗液連續(xù)沖洗5次,然

4、后于吸水紙上拍干,加入已摸索好的底物封口后于37℃作用2h,在沒(méi)有變色的條件下選擇盡可能大的酶標(biāo)抗體濃度。(四)待測(cè)標(biāo)本濃度的摸索選擇明確為陰性的標(biāo)本,以稀釋液做適當(dāng)稀釋(至少5倍以上,參考:100倍),封口后于37℃作用1h,按上述條件洗板(連續(xù)沖洗5次),加入已確定濃度的酶標(biāo)抗體,再洗板,再加入已確定的底物,選擇無(wú)明顯發(fā)色的最大濃度的標(biāo)本。二正式試驗(yàn)形成的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合,當(dāng)加入與酶相應(yīng)的底物時(shí),酶催化底而顯色,根據(jù)顏色的有無(wú)和顏

5、色的深淺對(duì)待測(cè)抗原進(jìn)行定性和定量。2.試劑與設(shè)備z純化抗待測(cè)抗原的抗體(包被用)。z酶標(biāo)抗體(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗待測(cè)抗原的抗體)z底物(鄰苯二胺OPD或四甲聯(lián)苯胺TMB)z底物緩沖液(Na2HPO40.184g構(gòu)椽酸0.047gH2O10mlH2O25ul)zPBS(見(jiàn)附錄)zpH9.6碳酸鹽緩沖液CBS(見(jiàn)附錄)z洗液(PBS0.05%體積的Tween20)z稀釋液(100mlPBS1g牛血清血蛋白)z終止液(2molLH2SO4)

6、z酶標(biāo)板(聚苯乙烯板)z微量加樣器z吸水紙z封口膠帶z酸標(biāo)儀z洗板機(jī)等3.實(shí)驗(yàn)步驟一予試驗(yàn)3(一)抗體包被的酶標(biāo)板的制備1.以碳酸鹽緩沖液將抗體稀釋成適當(dāng)濃度(參考:5ugml),加入酶標(biāo)板(50ul孔),以膠帶封口,于4℃過(guò)液。2.棄抗體液,以雙蒸水沖洗3次,自然干燥后以膠帶封口。此為由已知抗體包被的酶標(biāo)板,備用。(二)底物濃度的摸索在底物緩沖液中加入不同量的底物(參考:5mg10ml),加入酶標(biāo)板中(50ul孔),以膠帶封口,37℃

7、避光保存2h,在沒(méi)有明顯變色的條件下選擇盡可能大的底物濃度。(三)酶標(biāo)抗體濃度的摸索用稀釋液稀釋酶標(biāo)抗體至適當(dāng)倍數(shù)(參考:40~4000倍),加至已包被抗體的酶標(biāo)板中(50ul孔),封口后于37℃作用30min。以洗液連續(xù)沖洗5次,然后于吸水紙上拍干,加入已摸索好的底物封口后于37℃作用2h,在沒(méi)有變色的條件下選擇盡可能大的酶標(biāo)抗體濃度。(四)待測(cè)樣本濃度的摸索選擇明確為陰性的標(biāo)本,以稀釋液做適當(dāng)稀釋(至少5倍以上,參考:100倍),封

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