骨化三醇對(duì)晚期糖基終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的NRK52E細(xì)胞EMT的影響.pdf

1、目的：
　　在糖尿病微環(huán)境中，晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）對(duì)腎臟細(xì)胞產(chǎn)生損害作用，主要機(jī)制是通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和導(dǎo)致腎臟細(xì)胞上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）。我們用AGEs刺激腎小管上皮細(xì)胞，觀察上皮細(xì)胞的 EMT，并且檢測(cè)細(xì)胞的 AGEs受體（receptor for advanced glycation

2、 end products, RAGE）的表達(dá)及NF-κB的磷酸化水平的改變等。骨化三醇對(duì)腎臟有重要保護(hù)作用，但保護(hù)機(jī)制尚不明確。用骨化三醇對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，進(jìn)行相應(yīng)的觀察，以探討骨化三醇是否對(duì)AGEs誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的EMT產(chǎn)生影響。
　　方法：
　　1.不同濃度的AGE-BSA(0、100、200、300μg/ml)與相應(yīng)濃度的BSA孵育 NRK52E細(xì)胞48h，Western blot檢測(cè)上皮標(biāo)志物E-cadher

3、in間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA以及AGEs特異性受體RAGE表達(dá)的改變。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、低濃度(10nmol/L)骨化三醇組、高濃度(100nmol/L)骨化三醇組，Western blot檢測(cè)經(jīng)骨化三醇處理細(xì)胞后的E-cadherin和α-SMA的水平變化。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組，AGEs處理組、低劑量骨化三醇+AGEs處理組，高劑量骨化三醇+AGEs處理組。Western blot、熒光定量 PCR、免

4、疫熒光觀察 E-cadherin、α-SMA的表達(dá)變化及普通顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)改變，并觀察細(xì)胞 RAGE的變化和NF-κB磷酸化的水平改變。
　　4.實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組，AGEs誘導(dǎo)組，50g/ml抗RAGE中和抗體+AGEs組，Western blot檢測(cè)E-cadherin、α-SMA的相對(duì)變化。
　　5.實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、AGEs處理組、100nmol/L骨化三醇預(yù)處理+AGEs組、100nmol/L骨化三醇＋I(xiàn)MD0

5、354預(yù)處理+AGEs組，Western blot檢測(cè)RAGE的相對(duì)變化，熒光定量PCR檢測(cè)RAGE的mRNA相對(duì)表達(dá)變化。
　　6. SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件做單因素方差分析組間差異。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度的AGEs孵育NRK52E細(xì)胞48h以后，上皮標(biāo)志物E-cadherin下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA以及 AGEs特異性受體RAGE較空白對(duì)照組表達(dá)上調(diào)（P<0.05），并且具有濃度依賴性。
　　2.分

6、別低劑量（10nmol/L）和高劑量（100nmol/L）骨化三醇處理NRK52E細(xì)胞24h后，上皮標(biāo)志物E-cadherin，間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA表達(dá)并未有明顯改變.
　　3.Western blot、熒光定量PCR、免疫熒光都觀察到一致結(jié)果，即：較空白對(duì)照組，AGEs組的E-cadherin顯著下調(diào)（P<0.05），α-SMA顯著上調(diào)（P<0.05），其結(jié)果能夠被骨化三醇所逆轉(zhuǎn)（P<0.05），高濃度較低劑量骨化三醇逆轉(zhuǎn)程度高

7、。AGEs組的RAGE、NF-κB磷酸化水平明顯上調(diào)（P<0.05），但能被被骨化三醇所逆轉(zhuǎn)（P<0.05），高濃度較低劑量骨化三醇逆轉(zhuǎn)程度高。普通顯微鏡下，空白對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)呈多邊形，AGEs組細(xì)胞形態(tài)呈梭形，骨化三醇+AGEs恢復(fù)到多邊形形態(tài)。
　　4.預(yù)先阻斷RAGE，可扭轉(zhuǎn)AGEs誘導(dǎo)的E-cadherin的顯著下調(diào)以及α-SMA表達(dá)的顯著上調(diào)（P<0.05）。
　　5.RAGE的表達(dá)在AGEs較空白對(duì)照組顯著上調(diào)

8、（P<0.05），100nmol/L骨化三醇預(yù)處理+AGEs組較AGEs組，RAGE和上調(diào)水平下降（P<0.05），但較100nmol/L骨化三醇預(yù)處理+AGEs組，100nmol/L骨化三醇＋I(xiàn)MD0354預(yù)處理+AGEs組，RAGE顯著上調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、用AGEs成功構(gòu)建NRK52E細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化模型。
　　2、單獨(dú)用骨化三醇刺激細(xì)胞，并未骨化三醇處理細(xì)胞并不能影響細(xì)胞的標(biāo)志物表達(dá)水

9、平的改變。
　　3、骨化三醇可逆轉(zhuǎn)AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞的EMT，并且可能是通過(guò)逆轉(zhuǎn)AGEs誘導(dǎo)的RAGE、NF-κB磷酸化水平實(shí)現(xiàn)的。
　　4、阻斷RAGE，可阻斷AGEs引起的細(xì)胞的EMT，說(shuō)明AGEs誘導(dǎo)細(xì)胞的EMT是通過(guò)RAGE實(shí)現(xiàn)的。
　　5、骨化三醇可降低RAGE的表達(dá)和NF-κB磷酸化水平，預(yù)先用NF-κB磷酸化抑制劑處理，可削弱骨化三醇對(duì)RAGE的降低水平。說(shuō)明骨化三醇對(duì)RAGE水平的降低是部分通過(guò)NF-κ